[发明专利]NPM1基因突变检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.本发明提供NPM1基因突变检测方法，包括以下步骤：

(a)提取待检样本的DNA；

(b)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA进行PCR扩增；

(c)用自行设计的用于检测NPM1基因12号外显子开放阅读框多种突变位点的测序引物对步骤(b)中扩增后的DNA进行测序；

(d)将步骤(c)中的测序结果与标准NPM1基因12号外显子开放阅读框进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。

2.本发明根据人5号染色体基因组序列登录号：NT_023133.13设计NPM1基因12号外显子开放阅读框相关引物如下，

NPM1基因12号外显子开放阅读框PCR扩增引物：

NPM1F：5’-TCGGGAGATGAAGTTGGAAGTA-3’(NT_023133.13：15648494～15648515)；

NPM1R：5’-CATTTATCAAACACGGTAGGGA-3’(NT_023133.13：15648943～15648964)；

NPM1基因12号外显子开放阅读框测序反应引物：

NPM1R2：5’-GGACAGCCAGATATCAACT-3’(NT_023133.13：15648899～15648917)。

3.本发明还提供NPM1基因突变检测试剂盒，包括：PCR Amplification Mixture；Primer(sense，antisense)、HotStarTaq酶、消化酶、Sequencing Mixture。

4.根据权利要求3述NPM1基因突变检测试剂盒，其特征在于NPM1基因突变检测试剂盒采用HotStarTaq DNA Polymerase作为热启动酶，扩增反应体系为：每50μl中含5μl的10倍扩增缓冲液、2μl浓度为25mM的Mg2+、2μl浓度为10mM的dNTPs、1.5μl浓度为10μM的正向引物、1.5μl浓度为10μM的反向引物、0.3μl的Taq DNA聚合酶、1μl的DNA模板、余量为mH₂O，测序反应体系为：4μl的BigdyeV3.1、3μl的mH₂O、1μl浓度为10μM的Sequencing引物(F，R)、2μl的PCR产物。

5.根据权利要求3述NPM1基因突变检测试剂盒，其特征在于NPM1基因突变检测试剂盒采用的扩增反应步骤为：先95℃反应15min，进入循环，循环中先94℃反应0.5min，然后56℃反应0.5min，然后72℃反应1min为一个循环，共反应35个循环然后72℃反应7min，最后4℃保存。

6.根据权利要求3述NPM1基因突变检测试剂盒，其特征在于NPM1基因突变检测试剂盒采用的测序反应步骤为：先94。℃反应0.5min，然后50。℃反应0.5min，然后60。℃反应2.0min为一个循环，共反应24个循环。