[发明专利]一种可以同时检测六种治病微生物的悬浮芯片检测方法

说明书

技术领域

本发明提供一种可以对六种致病菌同时检测的悬浮芯片方法，涉及致病菌特有基因的引物及特异性探针的设计，还对悬浮芯片检测条件进行了优化。

背景技术

全球食源性疾病发病率不断上升，且有严重暴发流行。据报道，发达国家每年大约有30％的人患食源性疾病。这些国家食源性疾病的种类较多，常见的有霍乱、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌感染等，腹泻发病率和死亡率较高。世界卫生组织统计报告表明，全球因食物污染而致病者已达数亿人，每年约有几亿腹泻病例，导致约300万5岁以下儿童死亡，其中约70％是因生物性污染的食品所致。在发展中国家，估计每年腹泻及其相关疾病有2.7亿病例，导致240万5岁以下儿童死亡。尤其是今年5月在德国爆发的由出血性大肠杆菌O104:H4引发的“毒蔬菜”事件，经过一个多月的排查后，终于确定了造成此次大肠杆菌疫情的罪魁祸首元凶是产于德国北部的一家有机农场生产的豆芽。目前，此次疫情已造成约4000人感染，三十余人死亡。近日，感染了单核增生李斯特菌的甜瓜事件，在美国已经蔓延超过26个州，共造成133人感染，28人死亡的严重后果。可以说食源性致病菌污染问题已经迫在眉睫。

食源性致病菌的检测，除了常规的生化培养，血清学鉴定以外，近年来涌现除了许多新方法，包括以免疫学为基础的检验法(如免疫磁珠法、ELISA法等)；以分子生物学为基础的检验法(如PCR法、荧光PCR法、Nucleic acid sequence based amplification、基因芯片法等)，上述各方法不论是常规的生化培养鉴定还是新兴的快速检测方法，虽然已经能够成功的在种属和基因型的水平上对致病菌进行鉴定，但是如果把这些技术应用在常规诊断实验室上要么费时、费力、费钱，要么检测的敏感性差，漏检、错检多，急需有一种能够多通道、快速、准确、敏感地检测致病菌的方法，因此本发明提出了一种利用悬浮芯片快速、简便的检测方法，它能够实现同时检测多种致病菌的目的。

悬浮芯片是由许多羧基化微球为主要基质构成的，这些乳胶微球是由聚苯乙烯制成的大小均一的圆形微球，在其制作过程中按照严格比例掺入两种荧光染料，使得每个球形基质都有独特的光谱地址。微球表面可以共价结合各种各样的核酸或蛋白质检测探针，在杂交反应进行时再加上荧光标记。在同一反应体系中可以同时加入不同的检测微球，这样就可以利用少量的样本进行快速、高通量的检测。通过微流体技术将微球排成单列快速流经Luminex检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球基质中的颜色，可根据微球的光谱地址而定性；而绿色激光则激发结合在待测样本上的荧光标记进行定量。最后，通过软件，可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度。这使得悬浮芯片技术不但具有高通量的特性，而且具有重复性好、灵敏度高、信噪比好、灵活性大的优势，已经广泛应用于病原体检测、遗传性疾病筛检、基因表达分析、细胞因子等的测定。

发明内容

本专利的目的是克服现有技术的不足，提供一种灵敏度高、特异性好，可同时检测六种常见致病菌(大肠杆菌O157:H7、志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌)的悬浮芯片检测方法。

本专利提供的技术方案是一种可以同时检测六种治病微生物的悬浮芯片检测方法，其中包括针对六种致病菌特有基因分别设计的引物，下游引物末端使用生物素标记，根据PCR扩增区内核酸序列设计特异性捕获探针，探针末端氨基C12修饰；所设计探针分别与Luminex编码微球偶联，偶联探针后的微球在一定条件下可以特异性地捕获生物素化的PCR产物，通过结合的链霉亲和素藻红蛋白，经Luminex检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球基质中的颜色，可根据微球的光谱地址而定性；而绿色激光则激发结合在待测样本上的链霉亲和素藻红蛋白进行定量。最后，通过软件，可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度。

本专利还包括一种多重悬浮芯片的检测方法，其中该方法包括步骤：1)单一、多重PCR的反应体系、反应条件；2)偶联探针的微球与目标物杂交温度的摸索；3)探针特异性验证方法；4)单一、多重检测的标准曲线绘制、检测范围及最低检出限的确定；5)方法检测灵敏度测定；6)方法特异性验证。