[发明专利]一种检测水稻线粒体组型的SRAP分子标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记检测技术领域，更具体涉及一种定性检测水稻不育系和种质资源中线粒体组型的方法，适用于各种常规水稻品种、杂交稻组合和不育系的鉴定、检测。

背景技术

水稻线粒体属于母系遗传，因而通过线粒体标记可以追踪水稻细胞质的来源。线粒体虽然被认为突变速率慢于细胞核，但由于线粒体基因间区域容易发生重组或者发生细胞内基因组的交流，因而变异也非常丰富。这种差异在遗传水平可作为线粒体基因组的特异分子标签。利用线粒体分子标签可以标记线粒体组型，因而能有效区分不同的水稻品种。由于分子标记具有唯一性，可以通过简单的PCR扩增技术跟踪特定的基因组型。具有操作简单、结果可靠、效率高、不依赖表型等优点，在遗传育种上已被广泛应用，具有非常广阔的应用前景。

在农作物杂种优势利用中，细胞质雄性不育系是最常用的不育类型，创建某一类型细胞质雄性不育系的分子标记有助于区分不同类型杂交品种。盖树鹏等曾试图发展洋葱细胞质雄性不育系线粒体基因组的特异性SCAR分子标记。由于其获取的A、B之间两条RAPD差异条带在转化成SCAR标记后，一条没有特异性扩增，而另一条不能与细胞质雄性不育株发生共分离(盖树鹏，孟祥栋，徐丽娟。大葱雄性不育分子标记辅助选择的研究。分子植物育种，2004，2(2)：223-228)，缺乏特异性，在实际生产中没有应用价值。

而何光华等利用RAPD技术筛选了水稻野败型珍汕97A和珍汕97B叶绿体基因组的差异，在A、B之间找到了一条特异性的稳定扩增条带，测序发现该序列位于叶绿体tRNA-Leu gene的上游，其中A较B中多了一段包含AGAAAA六碱基的重复片段单元，据此序列将其转换成SCAR标记后，该片段在5个野败不育系中可以稳定扩增，而保持系中没有。因此，他们认为该片段可以作为筛选野败型不育系的特异性分子标记(He GH，Hou L，Xiao YH et al.Euphytica，2003，131：269-274)。此外，日本的Ichii等在野败型不育系珍汕97A中发现一条1.6Kb的差异性扩增带。进一步提取不育系、保持系和恢复系的线粒体基因组DNA进行PCR验证，发现该片段为不育系线粒体所特有，而保持系和恢复系线粒体均不含此片段。对杂种F1和F2的验证表明该片段与不育株共分离，说明该标记的确为野败型不育系所特有。但若以该标记引物对DA型不育系线粒体DNA进行扩增，其扩增带为两条，一条为0.7Kb，一条为1Kb，与野败型的不同(Ichii M，Hong DL，Ohara Y et al.Euphytica，2003，129：249-252)。以上两种方法均建立在野败型不育系珍汕97A中特异性扩增的DNA片段基础之上，只能跟踪具有与珍汕97A完全相同的细胞质，因而主要适用于野败型杂种及其细胞质线粒体组型的鉴定。

在配子体型细胞质雄性不育系中，包台型细胞质雄性不育的相关基因orf79和红莲型细胞质雄性不育相关基因atp6-orfH79，属于等位基因变异(Kadowaki KT，Suzuki T，Azama S.Mol Gen Genet，1990，224：10-16；Yi P，Wang L，Sun QP，ZhuYG.Chinese Science Bulletin，2002，47：744-747)。而且以orf(H)79作为PCR分子标记在水稻中筛选到一系列携带该基因的种质资源，说明该基因分布广阔，不为包台和红莲所特有。因此，利用不育基因orf(H)79作为分子标记不足以有效区分某一类型的细胞质，需要有更多其他分子标记的参与。

与此同时，植物线粒体基因组中积累了大量的非编码DNA序列，他们并不编码与细胞质雄性不育相关的功能基因，这些特定的DNA序列虽然在某一水稻生态型中具有唯一性，可以作为某一个或某一类野生稻和农家种细胞质线粒体组型标记。为了便于鉴定水稻线粒体组型，并通过线粒体组型进一步鉴定水稻品种和杂交稻组合，我们根据水稻线粒体基因组重复序列区的分子特征设计引物，通过大量筛选，建立了一套多态性丰富、稳定可靠的分子标记，可以有效区分不同的水稻线粒体组型。用于不育系和水稻品种的遗传鉴定。

发明内容

本发明公开了一种定性检测水稻线粒体组型的一套SRAP分子标记的方法，它以水稻线粒体基因组遗传变异为基础，通过对线粒体重复序列区的广泛筛选，建立了一套多态性丰富、检测灵敏的分子标记。快速、准确地通过实验手段检测水稻品种和种质资源。本发明方法操作简便、稳定可靠，可用于不同细胞质雄性不育系鉴定和水稻品种的鉴定，具有准确、高效、快速的特点，提高了不育系和新品种鉴定的效率。