[发明专利]河西绒山羊流产病抗性等位基因检测试剂盒和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物生物技术领域中的山羊分子标记辅助育种技术，具体涉及到河西绒山羊流产病抗性等位基因检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

羊流产病是由衣原体、弓形虫、布鲁氏杆菌感染等因素引起以羊大量流产为特征的地方性亚急性传染病, 羊只患病后表现为流产、产弱羔、死羔等。河西绒山羊流产病发病率较高，平均流产率为25.41%，最高可达83.33%。

动物主要组织相容性（基因）复合体（major histocompatibility complex ，MHC）与多种疾病有密切关系，是目前开展抗病育种的首选基因座或候选基因。山羊的MHC基因的结构和功能与绵羊、牛的非常相似，并具有高度的序列同源性，分为class I、classII和class III区。GOLA classII基因区域与人的结构相似，其多态性集中在Ⅱ类区域的DR和DQ基因家族，DR基因家族有A、B两类基因座，包括1个DRA1功能基因和9个DRB基因，其中DRBl、B3、 B5是功能基因，其余是假基因。DRB1是II类区域中多态性最丰富的基因，这些多态性的产生主要由第二个外显子编码的氨基酸序列差异性所决定的。据颜卫华（2002年）报道，HLA与人的不明习惯性流产相关。但动物的传染性流产病与MHC的关系还未见报道。

目前国内对山羊流产病主要采用药物防治措施，较难控制病情且有药物残留风险。在国外MHC基因已经作为多种动物疾病的遗传标记加以应用，并且多种检测技术检测已商业化并用来开展抗病选育。河西绒山羊流产病抗性分子选种技术主要利用PCR-SSCP技术对待测山羊的DRB1基因第2外显子进行多态性分析，然后根据检测结果确定携带不同等位基因的羊只对流产病的抗性强弱，从而判断是否可以留作种用。

发明内容

本发明的目的是避免现有检测技术的不足提供一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒。以解决快速、敏感性高、成本低用于抗河西绒山羊流产病性分子选种技术。通过PCR-SSCP对表型正常和流产个体GOLA-DRB1基因第2外显子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合表型观测资料，确定易感等位基因和抗性较强的等位基因，为河西绒山羊没有感染时的抗病选育进行指导。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点是包括有第一PCR反应液，第二PCR反应液，GOLA-DRB1*03和GOLA-DRB1*11的DNA标准样；SSCP检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；

所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0. 025%溴酚蓝，0. 025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH 8. 0；

所述的第一PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL ，Mg^2 +浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为  100μM，引物DRB1.1和GIo各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH₂O补充体积至20μL；

所述的第二PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL ，Mg^2 +浓度为2.5mM，dNTPs 的终浓度为100μM，引物DRB1.1和DRB1.2各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，稀释10倍后的第一轮PCR产物1.0μL，ddH₂O补充体积至20μL；

引物序列为：

DRB1.1，5’-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3’,

GIo，5’-CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3’，

DRB1.2，5’-TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3’。

所述的GOLA-DRB1*03的DNA标准样的核苷酸序列为：

ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggc gcggttcctg       60

gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttgg acaacgactg gggcgagttc      120