[发明专利]河西绒山羊流产病抗性等位基因检测试剂盒和使用方法

权利要求书

1.一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒，其特征是包括有第一PCR反应液，第二PCR反应液，GOLA-DRB1*03和GOLA-DRB1*11的DNA标准样；SSCP检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；

所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0. 025%溴酚蓝，0. 025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH 8. 0；

所述的第一PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL ，Mg^2 +浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为 100μM，引物DRB1.1和GIo各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH₂O补充体积至20μL；

所述的第二PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL ，Mg^2 +浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为 100μM，引物DRB1.1和DRB1.2各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，稀释10倍后的第一轮PCR产物1.0μL，ddH₂O补充体积至20μL；

所述的GOLA-DRB1*03的DNA标准样的核苷酸序列为：

ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggc gcggttcctg    60

gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttgg acaacgactg gggcgagttc   120

cgggcggtgg ccgagctggg gcggcagacc gccaagtact ggaacagcca gaaggagctc   180

ctggagcgga ggcggaccga ggtggacacg ttctgcagac acaactacgt ggtcttt      240

所述的GOLA-DRB1*11的DNA标准样的核苷酸序列为：

ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggt gtggtacctg    60

gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttcg acaacgactg gggcgagtac   120

cgggcggtgg ccgagctggg gcggccggac gccaagtact ggaacagcca gaaggagatc  180

ctggagcagaggcggaccgaggtggacacggtgtgcagacacacatacggggtaggt     240。

2.如权利要求1所述的河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为： 

（1）待检基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中第一PCR扩增液混合，按上述第一组引物PCR反应条件进行扩增；

（2）试剂盒中第二PCR扩增液与步骤（1）的PCR扩增产物混合，按上述第二组引物PCR反应条件进行扩增；

（3）用步骤（2）中扩增的PCR产物和GOLA-DRB1*03或GOLA-DRB1*11的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测； 

（4）步骤（3）中检测到的带型与GOLA-DRB1*03或GOLA-DRB1*11标准样带型一致的样品为携带河西绒山羊流产病抗性等位基因的个体。

3.一种河西绒山羊流产病抗性等位基因PCR-SSCP检测方法，其特征在于，具体的检测步骤如下：

（1）样品采集：采集表型正常和流产病的河西绒山羊，颈静脉采血10ml, ACD抗凝, - 20 ℃冻存；

（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；

（3）聚合酶链式反应：

第一轮PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL ，Mg^2 +浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为 100μM，引物DRB1.1和GIo各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH₂O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 1min，退火60℃ 2min，延伸72℃2min，共30个循环，最后延伸72℃ 5 min；

第二轮PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL ，Mg^2 +浓度为2.5mM，dNTPs 的终浓度为100μM，引物DRB1.1和DRB1.2各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，稀释10倍后的第一轮PCR产物1.0μL，ddH₂O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 1min，退火60℃30s，延伸72℃30s，共25个循环，最后延伸72℃ 5 min；

引物序列为

DRB1.1，5’-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3’,

GIo，5’-CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3’，

DRB1.2，5’-TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3’；

（4）PCR产物的SSCP检测：

取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0. 025%溴酚蓝、0. 025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH 8. 0 ，98 ℃变性10min ，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压条件下，8 ℃电泳20h ，银染法显色后拍照；

（5）结果判断：

在河西绒山羊GOLA-DRB1基因第2外显子的PCR-SSCP检测，有26个等位基因，河西绒山羊流产病抗性等位基因为GOLA-DRB1*03的核苷酸序列为：ctggagtatcataagagcgagtgtcatttcttcaacgggaccgagcgggcgcggttcctggacagatacttctataatggagaagagtacgtgcgcttcgacaacgactggggcgagttccgggcggtggccgagctggggcggcagaccgccaagtactggaacagccagaaggagctcctggagcggaggcggaccgaggtggacacgttctgcagacacaactacgtggtcttt；

GOLA-DRB1*11核苷酸序列为：ctggagtatcataagagcgagtgtcatttcttcaacgggaccgagcgggtgtggtacctggacagatacttctataatggagaagagtacgtgcgcttcgacaacgactggggcgagtaccgggcggtggccgagctggggcggccggacgccaagtactggaacagccagaaggagatcctggagcagaggcggaccgaggtggacacggtgtgcagacacacatacggggtcggt；

易感等位基因为GOLA-DRB1*18的核苷酸序列为：ctggagtattacaagagagagtgtcatttcttcaatgggaccgagcgggtgcggttcctggacagatacttccataatggagaagagttcgtgcgcttcgacagcgactggggcgagttccgggcagtgaccgagctggggcggccggacgccgagtactggaacagccagaaggacttcctggagagcaggaggaccgcggtggacacgtactgcagatacaactacggggtcagg。