[发明专利]伏马毒素B2核酸适体及其应用

说明书

(一)技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术----SELEX技术设计和制备一种与伏马毒素B2高特异性和高亲和力结合的伏马毒素B2核酸适体及其应用。

(二)背景技术：

伏马毒素(Fumonisins，FB)主要是由真菌F.moniliforme和F.proliferatum产生的次级代谢产物，为多氢醇和丙三羧酸的双酯化合物，主要包括伏马菌素B1、B2和B3。其存在范围很广，从粟到谷物到香蕉等水果均可被污染，并存在于加工、贮存、运输等各个环节中，通过粮食加工、饲料生产等过程对畜牧业乃至人类健康产生较严重的危害。马是对伏马菌毒素最敏感的动物，伏马菌毒素中毒症有马脑白质软化病、猪肺水肿病、禽高死亡率或有毒饲料综合症等，此外，伏马菌素还表现出促癌活性。由于伏马菌毒素对动物和人类健康所存在的严重影响，通常是食品和饲料业主要担心的真菌毒素。

伏马菌素的检测方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、液相一质谱联用(LC-MS)、毛细管电泳法、酶联免疫(ELISA)等。前述这些方法虽具有较高的灵敏性和特异性，但需要复杂的净化提纯步骤和较贵重的仪器设备，不易推广使用；基于单克隆抗体或多克隆抗体的ELISA检测技术具有简单快速灵敏的特点，可同时检测大量样品，与HPLC法和LC-MS法相比，具有灵敏度高、干扰少、测定步骤简便、快速、操作安全、设备投资少、测定结果准确可靠的优点。然而，对于FB这种毒性小分子，其抗体的制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株(细胞)难以有效保存等难题，大大限制了酶联免疫吸附法等免疫学检测技术的快速发展。核酸适体(aptamer)作为一种特异性更好、亲和力更高、品质均一、稳定性好的抗体替代品，在检测分析领域中的应用已经被广为认可，并具有开发周期短、生产成本低、使用方便的特点，因此，核酸适体在FB这种毒性小分子的快速检测中具有良好的应用前景。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种采用新一代SELEX技术筛选得到的能够与伏马毒素B2高特异性和高亲和力结合的结构转换信号适体，并提供伏马毒素B2核酸适体在伏马毒素B2检测分析和样品分离富集中的应用方法，具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适体具许多优势。

本发明的技术方案：一种伏马毒素B2核酸适体，其特征在于它为核苷酸序列

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGACGAGGGTGACTATGGCGGTGGCGTCTGTGAGCATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。

所述的伏马毒素B2核酸适体的衍生物具有相同功能用途。

所述的伏马毒素B2核酸适体的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰。

所述的伏马毒素B2核酸适体的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。

一种伏马毒素B2核酸适体的应用，其特征在于将伏马毒素B2核酸适体用于伏马毒素B2的检测分析，它包括以下步骤：

(1)竞争板准备：50μg/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚赖氨酸100μl于4℃包被过夜，交联剂次亚苯基二异硫氰酸盐或戊二醛活化6h，200-2000pmol/ml NH₂-引物100μl偶联，0.2mol/L乙醇胺或甘氨酸封闭2h，硼氢化钠还原，1％BSA封闭，PBS洗涤后备用；

(2)检测步骤：

①伏马毒素B2核酸适体5-10pmol，94℃3min、冰上5min变性；

②与0-100pmol靶标混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；

③吸取50μl加入荧光板中，加入1∶200O OlGreen 100μl，作用5min；

④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。

标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。

重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。

回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。

FB2检测试剂盒：检测灵敏度：0.025ng/ml，重复性：CV＜5％