[发明专利]一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列及其高效表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及到碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列及其高效表达方法。 

背景技术

碱性高温果胶酶在生物脱胶中有着无与伦比的作用。随着社会的发展，国家对企业要求越来越高，节能减排成为企业的热门话题。苎麻生物脱胶和织物的生物煮练是一种绿色环保的脱胶方法，相比化学脱胶法，生物脱胶具有提高精干麻质量，不损伤纤维，无污染等优点。生物脱胶技术成为国内外苎麻研究者的研究热点，也是未来苎麻脱胶的主要发展方向。 

但是，在苎麻脱胶过程中所需要的高温碱性果胶酶，一般来源于芽孢杆菌和大肠杆菌，它们在原核细胞中可以大量表达，可若想得到大量较纯净的果胶酶，就必须进行一系列复杂的纯化过程。为了便于纯化，人们开始采用以毕赤酵母为表达菌株，毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要成份，然而由于来源基因密码子偏好的问题，使碱性果胶酶的产量偏低。 

因此，如何运用全基因重组合成法寻找新的碱性果胶酶基因序列，使其序列的5’端为EcoR I酶切位点、3’端为Not I酶切位点，整个序列不含有SalI、PmeI等限制性酶切位点；选择合适的表达载体，使表达的蛋白更易于纯化且具有更高的活性，极大的降低碱性果胶酶的生产成本，增加企业对其的利用率成为了我们的研究主题。 

发明内容

本发明的目的是： 

1、本发明提供并公开了一种序列的5’端为EcoRI酶切位点、3’端为NotI酶切位点，整个序列不含有SalI、PmeI等限制性酶切位点编码碱性果胶酶pel168s的优化基因序列及其基因制备优化方法 

2、本发明还提出了上述pel168s核苷酸优化序列的高表达方法。 

本发明目的之一的步骤为： 

(1)采用常规的PCR重叠引物延伸法。将pel168基因序列(Bacillus subtilis 168，GenBank登录号：AL009126)输入DNAworks软件，在密码子频率表中(Codon Frequency Table)选择P.pastoris，并在屏蔽限制性酶切位点选项中选择SalI、PmeI等酶切位点，得到相关的pel168 在毕赤酵母中表达的一系列优化基因序列及引物序列。 

(2)为了便于表达质粒的构建，在引物1的前端添加了EcoRI限制性酶切位点，引物42的5’端引入了NotI限制性酶切位点。 

(3)以上述引物序列互为模板，采用从两端引物向中间引物浓度递减的方法进行全长的扩增，即引物1、引物42浓度为80nmol/L，依次递减，但中间引物21、引物22浓度最低为0.625nmol/L。具体反应条件是94℃预变性5min，然后94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 90s，30个循环，再72℃延伸10min。 

(4)PCR产物用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化，和T载体连接转化，挑选转化子经过测序验证后得到和设计结果一致的pel168s优化序列。 

(5)优化后的pel168s序列与原始序列pel168相比，序列中的15％-25％的碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换，为了避免DNA序列中形成的二级结构对表达的影响，pel168s基因序列除去了编码产物自身的21个氨基酸的信号肽序列。其中优化后的pel168s序列与原始序列pel168相比，效果最好的是序列中的294个碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换。 

本发明目的之二的步骤为： 

(1)用本发明目的1中的PCR合成的基因序列经过限制性内切酶EcoRI和NotI处理后，与同样经过EcoRI和NotI处理的表达载体pPIC9K连接，构建重组质粒pel168s-9k。 

(2)重组质粒pel168s-9k经SalI线性化后转入毕赤酵母GS115中，得到阳性重组菌株GS115/pel168s-9k。