[发明专利]一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列及其高效表达方法

权利要求书

1.一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列，其特征在于优化后的pel168s序列与原始序列pel168相比，序列中的15％-25％的碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换，序列中除去了21个氨基酸的信号肽，整个序列不含有SalI、PmeI限制性酶切位点。

2.根据权利要求1所述的一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列，其特征在于优化后的pel168s序列与原始序列pel168相比，序列中294个碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换，序列中除去了21个氨基酸的信号肽，序列的5’端添加了EcoRI酶切位点、3’端引入了NotI酶切位点，整个序列不含有SalI、PmeI限制性酶切位点。

3.一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列方法，其特征在于优化步骤为：

(1)采用实验室常规的PCR重叠引物延伸法，将pel168基因序列(Bacillus subtilis 168，GenBank登录号：AL009126)输入DNAworks软件，在密码子频率表中(Codon Frequency Table)选择P.pastoris，得到相关的pel168s在毕赤酵母中表达的优化基因序列pel168s及引物序列；

(2)以上述引物序列互为模板，采用从两端引物向中间引物浓度递减的方法进行全长的扩增，即引物1、引物42浓度为80nmol/L，依次递减，但中间引物21、引物22浓度最低为0.625nmol/L；具体反应条件是94℃预变性5min，然后94℃30s，58℃30s，72℃90s，30个循环，再72℃延伸10min；

(3)PCR产物用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化，PCR产物和T载体连接转化，挑选转化子测序后得到和设计结果一致的pel168s优化序列；

(4)为了便于表达质粒的构建，在合成的序列两端分别引入了EcoRI和NotI的酶切位点，且优化的pel168s序列中不含有SalI、PmeI等限制性酶切位点。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列，其特征在于所述重组载体为将碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列插入出发载体pPIC9K，或载体pPIC3.5k、载体pPICZα的多克隆位点得到的重组表达质粒；所述重组菌是将碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列插入出发载体pPIC9K的多克隆位点得到的重组表达质粒转化毕赤酵母GS115得到的。

5.一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列的高表达方法，其特征在于步骤为：

(1)用权利要求1或2所述的碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列经PCR合成，再经过限制性内切酶EcoRI和NotI处理后，与同样经过EcoRI和NotI处理的表达载体pPIC9K连接，构建重组质粒pel168s-9k；

(2)重组质粒pel168s-9k经SalI线性化后转入毕赤酵母GS115中，得到阳性重组菌株GS115/pel168s-9k；

(3)将阳性重组菌株接种于25ml的BMGY培养基中，28℃，200rpm培养48h，至OD为10-20；

(4)将培养好的菌液5000rpm离心5分钟，去掉上清，转接于25ml的BMMY培养基中，25℃，200rpm培养84h，期间每隔12h补加甲醇至终浓度1％进行诱导；

(5)温度4℃，5000rmp离心过滤10min收集上清，上清液中含有大量的活性碱性果胶酶。