[发明专利]一种甘露聚糖酶重组表达载体和一种可自身分泌甘露聚糖酶转基因猪的培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及转基因工程技术，具体涉及一种甘露聚糖酶重组表达载体，以及利用该重组表达载体来培育可自身分泌甘露聚糖酶的转基因猪的方法。

背景技术

猪饲料中最主要的成分是玉米和豆粕等，这些谷物籽实是属于植物性饲料原料。植物含大量的纤维素、半纤维素及果胶聚糖等非淀粉多糖，因为它们是植物细胞壁的主要成分,甘露聚糖是植物性饲料原料中主要的一种非淀粉多糖。

研究发现，猪自身不能产生甘露聚糖酶。由于寄生于消化道的微生物种类和数量远少于牛或羊等多胃动物，猪也无法依靠消化道中的微生物分泌足量的甘露聚糖酶来降解饲料中植物细胞壁的甘露聚糖。因此，猪饲料中谷物籽实细胞内的营养物质在消化道中无法被充分释放出来供猪消利用。另一方面，由于甘露聚糖是可溶性非淀粉多糖，在猪消化道中难以消化的甘露聚糖会与大量的水结合，使食糜的黏稠度增加，从而降低猪消化道对食糜中营养成分的消化和吸收效率。可见，由于猪自身不能分泌甘露聚糖酶，植物性饲料原料中的甘露聚糖对猪来说就成为一种抗营养物质，它不但降低了猪对饲料营养物质的消化、吸收和利用效率，还增加了猪粪便中各种污染物，如氮、硫等的排放，对环境造成更大破坏。

    为了消除甘露聚糖对猪的抗营养作用，目前采用的主要方法是在猪饲料中添加通过微生物发酵生产的甘露聚糖酶。虽然部分研究证明在饲料中添加甘露聚糖酶可以提高猪对饲料营养物质的消化和吸收效率，并提高猪的生长性能，减少粪便中污染物排放，但是在饲料中添加甘露聚糖酶增加了饲料成本，降低了养猪利润。此外，由于饲料在制备过程通常有些工序需要在特殊条件下（例如高温）完成，这容易造成添加的甘露聚糖酶产生部分酶活损失，导致其水解饲料中甘露聚糖的效果不稳定或不理想。

因此，非常有必要开发更有效，更低廉的技术来消除猪饲料中甘露聚糖的抗营养作用，提高猪对饲料的消化和吸收效率，从而提高猪的生长性能及减少粪便中污染物的排放。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种由甘露聚糖酶基因和调控元件拼接后，插入到真核表达载体后所形成的，能够受调控元件调控表达甘露聚糖酶的甘露聚糖酶重组表达载体。

本发明的另一个目的在于提供利用上述甘露聚糖酶重组表达载体来培育可自身分泌甘露聚糖酶猪重构胚的方法。

本发明的另一个目的在于提供利用由上述甘露聚糖酶重组表达载体培育的重构胚进行转基因猪培育的方法。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种甘露聚糖酶重组表达载体，该重组表达载体是将外源的甘露聚糖酶基因和调控元件拼接后，插入到真核表达载体中，构建得到由调控元件调控表达的甘露聚糖酶重组表达载体。

上述甘露聚糖酶重组表达载体中，调控元件的作用是调控外源甘露聚糖酶在猪消化道组织特异表达，该调控元件可以为口腔组织特异表达的调控元件或腮腺组织特异表达的调控元件，也可以为胃组织特异表达的调控元件或肠组织特异表达的调控元件。

上述甘露聚糖酶重组表达载体中，外源的甘露聚糖酶基因是指任何一种本领域中已经公开的甘露聚糖酶基因，如来源于微生物、酵母或昆虫等的甘露聚糖酶基因。

上述甘露聚糖酶重组表达载体中，真核表达载体采用任何一种本领域技术人员常用于动物基因工程中的，并带有可在真核细胞表达的药物抗性基因（如新霉素基因等等）的真核表达载体，如真核表达载体pCMVp-NEO-BAN、真核表达载体pEGFP、真核表达载体pEGFT-Actin、真核表达载体pcDNA^TM3.1/myc His或真核表达载体pcDNA6/His^TM等等；药物抗性基因的作用是可用于筛选作为核供体细胞的转基因细胞。

一种培育可自身分泌甘露聚糖酶猪重构胚的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1

将上述的甘露聚糖酶重组表达载体转染猪胎儿成纤维细胞并经筛选后制备成转甘露聚糖酶基因的核供体细胞；

制备去核猪卵母细胞；

步骤2

将步骤1制备的核供体细胞注入步骤1制备的去核猪卵母细胞中形成重构胚；

将上述重构卵进行激活处理后，得到激活的重构胚。

上述步骤1中，核供体细胞可以用任意一种猪体细胞，但本发明人通过研究后发现，用猪胎儿成纤维细胞更有利于提高用克隆法制备转基因猪的效率。

上述步骤2中，将核供体细胞注入去核猪卵母细胞中，其注入方法采用显微注射的方法。

上述步骤2中，对重构卵进行激活处理，是采用电激活方法。