[发明专利]特异性检测鲑科鱼类的实时荧光PCR试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，特别是涉及一种涉及食品、饲料和其它鱼类加工产品中特异性检测和鉴定鲑科鱼类的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

近年来食品以次充好及假冒伪劣事件在我国乃至国际上时有发生，且越发严重。鲑科鱼类多为深海洄游鱼类，目前科学家已发现世界上共有鲑科鱼类品种66个。由于鲑科鱼肉，尤其是其中的“三文鱼”含有较高蛋白质和OMEGA-3脂肪酸，脂肪含量很低，具有很高的营养价值和食疗作用，因此受到广大消费者的喜爱。目前国内市场对鲑科鱼类的需求越来越大，而其价格不菲，受利益驱使，市场上鲑科鱼类是鱼龙混珠，以次充好现象时有发生。新鲜鱼肉本来就很难鉴别真伪，经过加工后，鲑鱼产品的真伪就更难分辨。

目前我国还没有相应的检测方法对进出口食品、饲料及加工产品中鲑科鱼类成分进行鉴别检测，也就是说目前进出口食品、饲料等产品中鲑科鱼类成分的鉴伪仍处于空白。这在一定程度上制约着我国食品进出口贸易的发展和我国水产品市场的有序进行。为了减少水产品进出口贸易摩擦、维护消费者知情权和自身利益、确保食品质量安全，促进市场上鲑科鱼类品种名称的规范化和统一化，迫切需要建立和制订进出口食品、饲料及鱼类加工产品中鲑科鱼类成分的检测和鉴别方法。目前国内外还没有食品、饲料及鱼类加工产品中鲑科鱼类成分检测方法的报道。

综上所述，鉴于目前尚没有特异性好、灵敏度高的食品、饲料及鱼类加工产品中鲑科鱼类检测方法。因此，本领域迫切需要开发特异性好、灵敏度高、简便快速的食品、饲料及鱼类加工产品中鲑科鱼类检测和鉴定方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性检测鲑科鱼类的实时荧光PCR试剂盒及检测方法。通过根据鲑科鱼类生长激素基因，设计特定的引物和TaqMan荧光探针，实现实时荧光PCR检测试剂盒的制备，并通过该检测试剂盒，能对鲑科鱼类进行快速、准确、简便和特异地检测和鉴定。

为解决上述技术问题，本发明的特异性检测鲑科鱼类的实时荧光PCR试剂盒，包括：PCR缓冲液、dNTP和DNA聚合酶，其中，还包括SEQ ID NO.1或2所示的上游引物(F1、F2)、SEQ ID NO.3所示的下游引物(R1)、SEQ ID NO.4所示的荧光探针(P1)。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还可包括SEQ ID NO.5所示的马苏大麻哈鱼(鲑科鱼类代表性品种)生长激素基因DNA标准品。

另外，本发明还提供一种特异性检测和鉴定鲑科鱼类的荧光PCR检测方法，包括步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)采用上述PCR试剂盒，对样本DNA和阴性对照样品，进行目的基因的实时荧光PCR反应，并进行荧光检测；

(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。

所述步骤(2)中的阴性对照样品，可按本领域常规方法选择，即选择非鲑科鱼类DNA样本，包括其它科、目的鱼类样品或其它动物组织DNA样品。

所述方法，还可同时以梯度浓度的上述DNA标准品溶液在与样品DNA相同条件下，进行PCR扩增反应，以DNA标准品溶液浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值(域值循环数)为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的浓度，从而对样品DNA进行定量检测。

所述PCR反应条件可按参照本领域常规实时荧光PCR方法，如本发明中PCR反应条件可为：50℃2分钟，95℃10分钟；进入循环，95℃15秒、60℃60秒，进行45个循环扩增。

PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)：1×实时荧光PCR预混液(上海辉睿生物科技有限公司)、0.25μM上游引物F1、0.25μM上游引物F2、0.5μM下游引物R1、0.2μM实时荧光探针P1，加入2-5μL DNA模板(50-100ng)，反应总体积通常为25μL。也可等比例配制20μL或50μL反应体系。

本发明通过特异性引物和荧光探针序列的设计，而试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作鲑科鱼类的定性检测，也可采用标准品做标准曲线后进行定量检测。本发明能够快速、准确地检测和鉴定食品、饲料和其它鱼类加工产品中鲑科鱼类成分，而且检测灵敏度高，特异性好，操作简便、快速，降低了常规PCR扩增的假阳性率。

附图说明