[发明专利]一种造血嵌合体实时定量PCR检测中嵌合体的合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种造血嵌合体实时定量PCR检测方法，特别涉及一种利用荧光染料SYBR green来检测造血嵌合体的实时定量PCR检测中的嵌合体的合成方法。

背景技术

随着异体造血干细胞用来治疗各种恶性和非恶性的血液疾病，许多病人延长了总的存活时间和无病生存时间。导致治疗失败的主要原因是疾病复发，移植物被排斥，移植物抗宿主病。因此定量分析病人异体干细胞移植后供体嵌合体是用来诊断移植物成活，早期检测和治疗疾病复发，移植物排斥反应的重要工具。异体造血干细胞移植后的嵌合体的监测已成为常规检查手段，特别是在RIC(Reduced Intensity Conditioning，降低强度条件)的异体移植，异体干细胞移植后供体嵌合体的结果可用来指导是否进行干预治疗，特别在改变免疫抑制治疗和治疗疾病的复发起到了决定性作用。

造血嵌合体的检测可以利用受体和供体多态性遗传标记或它的产物的不同来测量。目前广泛应用的方法包括细胞遗传学，红细胞分型，限制性片段长度多态性分析和免疫荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)技术通过XY染色体探头来测定。但是以上方法或者费时，或者不适用于所有病人。比如免疫荧光原位杂交(FISH)技术是通过XY染色体探头来测定造血嵌合体的，因此只适用于受体和供体是不同性别的异体造血干细胞移植；而红细胞分型方法只适用于不同血型的受体和供体。

近年来用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)实时定量检测造血嵌合体的方法因其应用的广泛和高灵敏度而越来越多地被使用。目前被接受的分子生物学方法是用PCR方法检测Microsatellite序列--一种短而重复不编码的序列。因为在不同的受体和供体中，此序列的重复数量不同从而造成PCR产物的大小不同。进而用丙烯酰胺凝胶电泳和自动序列分析PCR产物。此方法灵敏度相对较低(1～5％)，而且费时，费力，价格昂贵。

最近一种新的应用TaqMan技术检测单核甘酸多态性(SNP，Single Nucleotide Polymorphisms)的实时定量PCR方法被建立起来。SNP是等位基因变异，广泛表达在人的染色体编码与非编码区。大约每1000个碱基对就有一个单核苷酸多态性发生，因此为嵌合体的分析提供了一个广泛的信息标记库。此TaqMan技术的实时定量PCR方法需要应用特异的TaqMan探头，有价格昂贵而且保质期短的缺点。相比而言，能纳入双链PCR产物的荧光染料SYBR green因其便宜，高灵敏度而被广泛应用于实时定量PCR方法上。

发明内容

本发明的目的是建立了一种利用荧光染料SYBR green来检测造血嵌合体的实时定量PCR检测新方法及其嵌合体的合成方法，所述PCR检测新方法可以提高PCR检测的灵敏度，耗时低且节省费用。

为达到本发明的目的，本发明的检测造血嵌合体的实时定量PCR检测方法包括以下步骤：

S1.收集标本；

S2.选择多态性遗传标记设计引物和探针(probe)；

S3.实时定量PCR检测造血嵌合体；

S4.人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体；以及

S5.统计学分析。

造血嵌合体的检测关键在于选择可以区分受体和供体的特异性多态性遗传标记。本发明中介绍了12个可以用于实时荧光定量PCR(Real time Q-PCR)来检测造血嵌合体的特异性多态性遗传标记。用此12个多态性遗传标记对37对供体和受体进行筛选，结果表明每个多态性标记的信息性(informativity)在3％至47％之间。12个多态性遗传标记可以区别94％的供体和受体。除一对同卵双胞胎外，所有37对供体和受体都可以找到适合的特异性多态性标记进一步进行定量PCR来检测造血嵌合体。

为了弥补荧光染料SYBR green纳入双链DNA是非特异性的，同时运行熔解曲线(melting curve)可以用来验证PCR产物的特异性。进一步用人工合成12个不同稀释浓度的造血嵌合体(从0.01％至100％)，利用供体DNA来稀释受体DNA或受体DNA来稀释供体DNA，标准的扩增曲线由供体或受体特异的等位基因位点的PCR来扩增以上人工合成的造血嵌合体来作出。供体或受体的阴性等位基因可以用来作为阴性对照。移植后的供体细胞的百分比可以从标准的扩增曲线计算出来。