[发明专利]一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法，属于蛋白质工程领域，该产品为保持三螺旋结构的活性胶原，具有低免疫原性、高生物相容性，可生物降解，适用于医疗用途。

背景技术

胶原是脊椎动物体内含量最丰富、分布最广泛的一组硬蛋白，分子量约为300000，均可在细胞外形成超分子聚集物，大量存在于骨、软骨、肌腱及皮肤中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25％-33％。同一组织中常含有几种类型的胶原，常以某种为主。I型胶原遍布于肌体的各部分，主要为皮肤、肌腱及韧带中，具有很强的抗张能力。II型胶原主要存在于透明软骨、玻璃体中，具有较强的抗压能力。III型胶原广泛分布于伸展性大的组织中，如疏松结缔组织等，具有伸展性及应变性。其中，I型胶原占生物体总胶原量的90％，因此，I型胶原在生物材料中的使用也最广泛。

胶原在分子水平结构相同，由3条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型。3条左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构为胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定。3条链富含甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，酪氨酸含量也很低，但含独特的羟化氨基酸(羟脯氨酸和羟赖氨酸)。由于原纤维的方向性和成束直径及密度的不同，不同组织的胶原存在结构差异，并具有各自的功能和结构特征。在结缔组织中，胶原除了机械支撑外，还是细胞粘附和移动的重要物质基础，因此，胶原被认为是胚胎发育和组织再生中重要的形态发生因素，在组织工程中得到广泛应用。

能被称为胶原的，必须是其三螺旋结构没有改变的那类蛋白质，还保留有完全生物活性。而胶原蛋白是胶原的水解产物，胶原的三螺旋结构彻底松开，成为3条自由的肽链，且降解成多分散的肽段，其中包括小肽。因此胶原蛋白是多肽混合物，相对分子量从几千到几万，分子量分布很宽，没有生物活性，能溶于冷水，而且能被蛋白酶利用。

CN1110284中公开了一种胶原的制备方法，以酸提取，盐沉淀，膜过滤，最后冻干，其提取效率和纯度都较低。CN101250218公开了一种以鳕鱼皮为原料制备胶原蛋白的方法，其制备方法会破坏胶原的三螺旋结构。现有技术公开的方法在胶原的提取制备过程中往往破坏胶原的三螺旋结构，或者提取效率较低，无法实现既能够保留活性胶原的三螺旋结构，又同时提高提取效率和纯度。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的是提供一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法。本发明使用酸酶结合处理加渐进式超声波处理的制备方法，不仅能够保持胶原的三螺旋结构，同时显著的提高了胶原的提取效率。本发明使用H₂O₂溶液处理加酸溶盐析纯化加透析纯化有效的提高了胶原产品的纯度。

一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法，包括如下步骤：原料预处理、除脂、酸酶结合处理、超声波处理、H₂O₂溶液处理、酸溶盐析纯化、透析纯化、干燥。

所述的原料为选自新鲜猪皮、牛皮、牛跟腱中的一种。

所述的酸酶结合处理为：经过预处理的原料浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25～30小时左右。

所述的超声波处理优选采用渐进式超声波处理，先使用100～200W超声处理30分钟，再使用200～300W超声处理30分钟，最后使用300～400W超声处理1小时。

所述的一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法，具体步骤如下：

(1)取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破碎成小颗粒状，按照固液比1∶30～1∶40的比例，加入0.01～0.03mol/L的氢氧化钠水溶液，于6～8℃浸泡1～2小时，过滤，备用；

(2)在上述预处理后的猪皮中加入质量为猪皮质量6～8倍的无水乙醚或者丙酮，于35～40℃回流5-8小时，之后用蒸馏水冲洗至无异味，备用；

(3)将上述猪皮浸入0.6～0.7mol/L冰醋酸和600～700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25～30小时左右；

(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100～200W超声处理30分钟，再使用200～300W超声处理30分钟，最后使用300～400W超声处理1小时；

(5)加入2～3％的H2O2溶液，混合静置2～4小时，调节pH至5.0，离心；