[发明专利]枯草芽孢杆菌木糖诱导的外分泌表达载体

说明书

技术领域

    本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体pXYL-amyQ。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种革兰氏阳性细菌，其细胞壁不含内毒素，能形成芽孢，分泌蛋白能力强，是一些重要工业酶制剂的生产菌，自 1958 年 Spizizen发现枯草杆菌 168 菌株能摄取外源基因以后，随着 DNA重组技术的发明，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 带抗性标志的质粒可作为其载体的发现，枯草芽孢杆菌基因工程的工作迅速发展。

作为很有吸引力的外源基因表达的宿主,枯草芽孢杆菌有以下几种优点: ①枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物, 不产内毒素，美国食品和药物管理局（FDA）已经将枯草芽孢杆菌列为原则上认为安全的微生物GRAS (generally recognised as safe)宿主; ②拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统，赋予芽孢杆菌高效分泌表达目的蛋白的能力, 可以直接把目标蛋白分泌到培养基中，有利于蛋白的分离纯化及后期处理 ③良好的发酵基础和生产技术，培养条件简单，能高密度培养，生长周期短。是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。国内外在开发和使用枯草芽孢杆菌作为表达系统方面做了许多研究，但是到目前为止仍没有一套商业化高效的表达载体出现，研究和开发枯草芽孢杆菌的表达载体已经成为人们研究的重点之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种能在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源基因的枯草芽孢杆菌木糖诱导的外分泌表达载体pXYL-amyQ。将外源基因克隆到该表达载体，转化枯草芽孢杆菌，通过木糖诱导能够将有活性的目的蛋白分泌到细胞外，实现外源基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

为实现上述目的，本发明将枯草芽孢杆菌整合载体pAX01质粒上的木糖诱导的启动子序列作为该表达载体的启动子，为实现载体的严紧调控表达，将木糖诱导的启动子的阻遏基因序列加入到木糖诱导的启动子的前端，使其在不加诱导剂的情况下不能表达。同时引入信号肽序列，以实现表达的外源蛋白能够分泌到培养基中。

本发明的一种枯草芽孢杆菌木糖诱导的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其是以枯草芽孢杆菌质粒pHT43为出发质粒，去掉原有的启动子及其阻遏基因，插入枯草芽孢杆菌木糖启动子的表达盒和信号肽序列构建而成。

所述信号肽为α-淀粉酶基因信号肽，所述枯草芽孢杆菌木糖启动子的表达盒为木糖诱导的启动子及其阻遏蛋白。

所述α-淀粉酶基因信号肽是如下（a）或（b）的蛋白质：

  （a）由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸组成的蛋白质；

（b）将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与SEQ ID NO.1具有相同功能的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

所述阻遏蛋白具体为如下（c）或（d）的蛋白质：

(c) 由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸组成的蛋白质；

（d）将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与SEQ ID NO.2具有相同功能的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

所述α-淀粉酶基因信号肽为如下1）、2）或3）的DNA分子：

    1）其碱基序列是SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

    2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有相同功能的DNA分子；

    所述阻遏蛋白的编码序列为如下4）、5）或6）的DNA分子：

    4) 其碱基序列是SEQ ID NO.4所述的DNA分子；

    5）在严格条件下与4）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子

6）与4）或5）限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有相同蛋白功能的DNA分子；

   所述木糖诱导的启动子为如下7）或8）的DNA分子：

    7）其序列是序列表中SEQ ID NO.5所示的DNA分子；

8）与7）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同木糖诱导功能的DNA分子；

所述的外分泌表达载体pXYL-amyQ，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

   所述外分泌表达载体pXYL-amyQ在表达同源或外源蛋白中的应用。