[发明专利]鉴别连州虫草的特征性核苷酸序列及其探针和方法

说明书

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域，具体涉及用于鉴别连州虫草(Cordyceps lianzhounesis)的特征性核苷酸序列以及核苷酸分子探针和鉴别连州虫草的方法。

背景技术：

连州虫草(Cordyceps lianzhounesis)是属于广义虫草属(Cordyceps s.l.)的一种虫生真菌，该属真菌还包括冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)以及蛹虫草(Cordyceps militaris)。野生冬虫夏草是中国传统中药，具有保肺肾、补精髓、化痰止劳咳的作用，能够调节免疫功能，增强人体抵抗力。目前由于大量的采挖已经造成野生资源不足，价格大幅上张。目前，仍然无法实现冬虫夏草子实体的人工栽培，而其菌丝体培养也需要低温长期发酵，成本过高。蛹虫草又称北虫草或北冬虫夏草，具有益肺肾，补精髓，止血化痰的功能，与冬虫夏草具有相似的温补特性，同时含有冬虫夏草中含量极低的虫草素。连州虫草是我们发现的虫草新种，其与前两者具有相似的功能，而且可以很容易的进行发酵生产及栽培子实体，具有开发为虫草新产品的价值。因此可以快速而准确的鉴别连州虫草菌丝体、子实体以及相关制品真伪的方法和技术对于连州虫草生产相关企业以及相关检验机构将具有重要的意义。

DNA是生物储存遗传信息的物质，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，可以作为该生物物种或个体区别于其他物种或个体的标志。DNA是细胞生物的基本组成部分，作为遗传信息的载体，具有一定的稳定性，不会受表型的影响而改变，是用来鉴别物种、个体的可靠依据。通过生物信息学的分析可以找到不同物种或个体的特征性核苷酸序列，利用分子生物学的手段对该序列进行探测即可快速、准确的对物种或个体进行鉴别。发明人已申请并获授权两项鉴别尖头虫草及蜂头虫草的核苷酸特征性序列的专利，目前未见与连州虫草相关的核苷酸特征性序列的专利。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供来源于连州虫草(Cordyceps lianzhounesis)核糖体rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因，用于鉴别连州虫草的特征性核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的利用分子生物学手段鉴别连州虫草的特征性核苷酸序列来源于连州虫草核糖体rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因(核糖体rRNA内转录间隔区以及5.8S rRNA基因合并简称ITS区)，其序列如SEQ ID NO.1所示，所在位置以及特征见图1，该序列包含连州虫草的ITS1、5.8S rDNA以及ITS2的序列。该序列可通过实施例1所述的方法获得，亦可通过人工合成的方法在商业化的DNA合成仪器上按照发明人提供的核苷酸序列合成。

本发明以上述连州虫草的特征性核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)为模板而设计得到全长序列或不少于16个核苷酸组成的寡核苷酸序列，以及在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上经修饰、加工、变化而获得核苷酸序列，也包括在上述全长序列或寡核苷酸序列的基础上在5’端添加或改变10个核苷酸以下或改变原有核苷酸序列数量小于10％以及3’端6个核苷酸改变不足1个核苷酸的核苷酸序列作为连州虫草鉴定的专一性核苷酸分子探针。上述序列可通过DNA自动合成仪等DNA合成装置按照设计好的顺序合成而获得，并可以通过酶、同位素、生物素、化学荧光素、荧光剂等方式进行标记。

因此本发明的第二个目的是提供一种针对上述ITS区的如SEQ ID NO.1所示的序列的连州虫草专一性核苷酸分子探针，其特征在于，该连州虫草专一性核苷酸分子探针包括Probe I：5’-TTTACAACTCCCAAACCCCAGTG-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)和Probe II：5’-GCCGGAGAGGCGAGAGAG-3’(序列如SEQ ID NO.3所示)。进一步优选，所述的连州虫草专一性核苷酸分子探针还包括Probe III：5’-ACCTCTACCTCATCGTTGCCTCGGC-3’(序列如SEQ ID NO.4所示)。该序列经荧光标记后可作为Taqman探针用以鉴定连州虫草。Probe I、Probe II、Probe III的具体位置见图2，这些序列样适用于上述修饰、加工与变化、添加酶切位点、改变部分核苷酸序列以及标记等操作。