[发明专利]副溶血弧菌的链置换恒温扩增(SDA)快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物检测领域，具体涉及恒温扩增快速检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是一种嗜盐性细菌。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，海水中可存活47天。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。

副溶血性弧菌现有的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、荧光定量PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等。目前尚未见用链置换(SDA)恒温扩增技术快速、准确地检测上述菌株的试剂盒及其检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒及其检测方法。

本发明的另一目的是提供一种副溶血性弧菌的快速检测方法，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明提供的副溶血性弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括：

(1)模板预处理反应液：1×NEB buffer 2，1.0μM上游内引物S1、1.0μM下游内引物S2、3％(V/V)二甲基亚砜、和ddH₂O。

所述1×NEB buffer 2为：50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇、和ddH₂O，pH 7.9。

所述引物S1和S2分别如SEQ ID NO：1和2所示。

(2)链置换扩增反应液I：3％(V/V)二甲基亚砜，0.1mg/mL牛血清白蛋白，浓度分别为0.2mM的dATP、dGTP和dTTP，1.0mM dCTPαS，1×NEB buffer 2，和ddH₂O。

(3)BstDNA聚合酶；

(4)限制性内切酶BsoBI。

使用上述试剂盒检测副溶血性弧菌的方法，包括步骤：

(1)待检样品或细菌DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。

(2)模板预处理程序：

取模板预处理反应液23μL，加入待检DNA 2μL，放入94℃水浴5min后迅速放入59℃的水浴中45s；然后94℃水浴25s和59℃水浴45s过程反复进行6个以上循环；产物用作SDA模板。

(3)SDA扩增：将上述预处理的25μL模板溶液加入24.2μL链置换扩增反应液I中，95℃水浴加热5min，温度迅速冷却到0℃，然后加入0.4μL Bst DNA Polymerase与0.4μL BsoBI，置于59℃水浴反应1h。

(4)核酸凝胶电泳检测：

反应结束后，在反应管中加入6×Loading buffer(组分：30mM EDTA；36％(v/v)Glycerol；0.05％(w/v)Xylene Cyanol FF；0.05％(w/v)Bromophenol Blue)，自然冷却至室温，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测产物，100V电泳40分钟，电泳成像系统拍照。

电泳板上出现80bp的核酸扩增条带，说明待检样品为阳性，否则为阴性。

本发明的试剂盒根据目标菌株的保守基因序列设计引物，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的链置换扩增技术(SDA)技术，特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，检测方法简单、快速，特别适用于基层医疗机构及食品公司与相关检测部门。

附图说明

图1：其中，1阴性对照 2副溶血性弧菌样品 3副溶血性弧菌阳性对照 4 DNA Marker

具体实施方式