[发明专利]蛋白酶

说明书

本申请是申请日为2004年06月21日，申请号为200480017079.3(国际申请号为PCT/DK2004/000433)，名称为“蛋白酶”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及具有蛋白酶活性的与拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)蛋白酶同源的分离多肽，还涉及编码该多肽的分离的核酸序列。此外，本发明涉及核酸构建体，载体，以及包含这些核酸序列的包括转基因植物和非人动物的宿主细胞，还涉及生产及使用此蛋白酶的方法，尤其在动物饲料中。

本发明的蛋白酶具有高度的特异活性。公开了与蛋白酶的高特异活性有关的特有结构特征，该蛋白酶属于肽酶家族S2A或S1E。

发明背景

WO88/03947中公开了源于拟诺卡氏菌(Nocardiopsis sp.)NRRL 18262和达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的蛋白酶。DK申请no.1996 00013中公开了源于拟诺卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和氨基酸序列。WO 01/58276公开了与源于拟诺卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶有关的酸稳定性蛋白酶，以及源于Nocardiopsis alba DSM 14010的蛋白酶在动物饲料中的应用。然而，这些蛋白酶具有低的特异活性。

JP 2-255081-A公开了源于拟诺卡氏菌株系OPC-210(FERM P-10508)的蛋白酶，但没有序列信息。该株系(strain)已不能获得，因为其保藏已撤消。

DD20043218公开了源于Nocardiopsis dassonvillei株系ZIMET 43647的蛋白水解制剂，然而没有序列信息。该株系看起来已无法获得。

公布于本发明首次申请日之后的JP 2003284571-A公开了源于拟诺卡氏菌TOA-1(FERM P-18676)的蛋白酶的氨基酸序列和相应的DNA序列。该序列已登录到GENESEQP，条目号为no.ADF43564。

最为同源的已有非拟诺卡氏菌蛋白酶是SapII_Streptomyces_sp_sptrembl_q55353，其成熟部分与SEQ ID NO：2和6的成熟部分分别具有61.5％和63.5％的氨基酸同一性。相应的DNA与SEQ ID NO：1和5分别具有70.3％和72.7％的同一性。相关的链霉菌(Streptomyces)蛋白酶的成熟部分即SapII_Streptomyces_sp_sptrembl_q55352与SEQ ID NO：1的成熟部分具有稍高的同一性百分率，即70.8％。

本发明的目的是提供具有高特异活性的与拟诺卡氏菌蛋白酶同源的蛋白酶，尤其是具有用于动物饲料和/或洗涤剂潜力的蛋白酶。

发明概述

已分离并鉴定了具有高特异活性的蛋白酶，即源于Nocardiopsis alba DSM 15647(见SEQ ID NO：1和2)的蛋白酶，和源于Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei DSM 43235(见SEQ ID NO：5和6)的蛋白酶。

第一个方面，本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，且在pH 7.5和25℃下具有至少39AU/g的针对血红蛋白的特异活性，其中多肽选自下组：(a)具有与SEQ ID NO：2的1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO：6的1-192位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低严谨条件下与SEQ ID NO：1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO：5的568-1143位核苷酸杂交的核酸序列所编码的多肽；(c)由与SEQ ID NO：1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO：5的568-1143位核苷具有至少74％同一性的核酸序列所编码的多肽。本发明还涉及编码这样的蛋白酶的分离的核酸序列；核酸构建体，载体，和包含此核酸序列的宿主细胞；还涉及生产此蛋白酶的方法，以及在尤其是动物饲料方面使用此蛋白酶。

第二个方面，本发明涉及：