[发明专利]猪瘟病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

权利要求书

1.一种猪瘟病毒核酸定量检测引物和探针，包括如下的序列组：

1）包括下述正向引物，反向引物和荧光探针的一组序列：

正向引物：5'-AACGGYAGTGCTTTCTAYC-3'，

反向引物：5'-GTGGRAAAGGCTTCTCTC-3'，

荧光探针：5'- accActTctGtyCtca -3'，其中下标为LNA修饰；

2）上述1）中序列的5’ 端和/或3’ 端有延长的核苷酸片段的一组序列；

3）与上述1）或2）中序列的同源性大于85%，且具有特异性的一组序列；

4）与上述1）或2）或3）中序列的碱基互补的一组序列；

5）上述1）、2）和3）中任何三个或多个序列形成的具有正向引物、反向引物以及与之向对应的荧光探针的序列组；

其中，所述序列中Y为C或T，R为A或G。

2.根据权利要求1中所述的引物及探针，其特征在于，其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

3.含有权利要求1或2所述引物和探针的猪瘟病毒核酸定量检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：

（1）PCR反应液；

（2）RNA提取液；

（3）阴性质控品，为不含猪瘟病毒E2基因的PSG-TS载体质粒DNA片段；

（4）阳性质控品，为含1.0×10⁶ copy/ml猪瘟病毒基因组DNA片段；

（5）临界阳性质控品，为含1.0×10⁴ copy/ml猪瘟病毒基因组DNA片段； 

（6）工作标准品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其中，（1）PCR反应液，包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的HotStart Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTP Mix、10×PCR Buffer、MgCl₂溶液，所述引物及探针溶于PCR反应液中。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA提取液分为溶液1，溶液2，溶液3，溶液4及溶液5，其中溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75%乙醇，溶液5为DEPC处理水。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：

a、工作标准品1，含有1.0×10⁷ copy/ml的猪瘟病毒E2基因的非传染性DNA片段；

b、工作标准品2，含有1.0×10⁶ copy /ml的猪瘟病毒E2基因的非传染性DNA片段；

c、工作标准品3，含有1.0×10⁵ copy /ml的猪瘟病毒E2基因的非传染性DNA片段；

d、工作标准品4，含有1.0×10⁴ copy /ml的猪瘟病毒E2基因的非传染性DNA片段。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分含量的配比为：DEPC处理水23.1 μl；5 U/μl的热启动Taq酶0.4 μl；200 U/μl M-MLV反转录酶1 μl; Rnase抑制剂0.5 μl；10 mmol/l 的dNTP Mix 2 μl； 10×一步法RT-PCR Buffer 5 μl；25 mmol/l的 MgCl₂溶液用量9 μl；10 μmol/l的猪瘟病毒正向引物用量1.5 μl；浓度为10 μmol/l的猪瘟病毒反向引物用量1.5 μl；浓度为10 μmol/l的猪瘟病毒探针用量1 μl。

9.权利要求1或2所述引物及探针，或权利要求3~8任一所述试剂盒在检测猪瘟病毒核酸中的应用。

10.一种利用权利要求3~8任一项所述的试剂盒检测猪瘟病毒核酸的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

样品预处理：采集血清、鼻咽拭子、咽拭子或是病料组织；

（2）RNA提取：取已处理的样本200 μl，加600 μl溶液1，充分震荡混匀，室温静置10 min；加150 μl溶液2，再次充分震荡混匀，室温静置5 min，13,000 rpm离心15 min，取上清置等体积预冷的溶液3中，温和颠倒混匀，静置10 min，12,000 rpm离心10 min，弃上清，加入1,000 μl 75%溶液4洗涤沉淀2次，8,000 rpm离心5 min，去上清，干燥 2～5 min，加15～30 μl溶液5溶解，-80 ℃保存；其中溶液1为Trizol试剂，溶液2为氯仿，溶液3为异丙醇，溶液4为75%乙醇，溶液5为DEPC处理水；

（3）加样：向装有45 μl PCR 反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品，阴性质控品，阳性质控品，临界阳性质控品，工作标准品各5 μl，盖好管盖，5,000 rpm离心10 s；

（4）PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；

42℃ 60 min，1个循环；

    94℃ 5 min，1个循环;

    94℃ 30 s ，58℃ 45 s，5个循环；

94℃ 30 s ，58℃ 45 s，35个循环；收集荧光信号，在反应程序的第四步的终了读取荧光值;

（5）分析判断：Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性。