[发明专利]可裂解连接单元及其合成方法与用途

说明书

技术领域

本发明涉及用于DNA合成测序的化合物的化学合成领域，尤其涉及一类新型可裂解连接单元及其合成方法与用途。

背景技术   

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序（DNA sequencing）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。

合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制四种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。 

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终端”（reversible terminator）。这类核苷酸除了要求3ˊ-羟基阻断外，为了不影响下一个指示核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如荧光素，连接起来。然后，在下一个指示核苷酸并入之前，在温和条件下使这个连接单元断裂，继续DNA链的延长，从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有二硫键、光裂解、Pd催化裂解、氟化物可裂解等。

Robi D. Mitra Jay, Shendure Jerzy Olejnik, Edyta-Krzymanska-Olejnik and George M. Churcha. Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies. Analytical Biochemistry 320 (2003) 55–65.该文献中报道了一种二硫键连接单元，通过该连接单元把荧光素和脱氧核苷酸连接起来，该核苷酸在聚合酶作用下并入并被检测后，在2-巯基乙醇的作用下使二硫键断裂，实现测序的循环。Gerardo Turcatti, Anthony Romieu, Milan Fedurco and Ana-Paula Tairi. A new class of cleavable fluorescent nucleotides:synthesis and optimization as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis. Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No. 4 .该文献中报道以二硫键作为可裂解连接单元，合成了一类新的荧光标记核苷酸作为可逆终端，用于DNA合成测序，但是，只能测定10个核苷酸序列，读长太短。但是Pleasants, J. C.; Guo, W.; Rabenstein, D. L. J. Am. Chem. Soc. 1989,111, 6553-6558和Huyghues-Despointes, B. M. P.; Nelson, J. W. Biochemistry 1992, 311476-1483两篇文献中报道在某些条件下，二硫键不稳定，并且二硫键的形成和断裂是一个可逆的过程。