[发明专利]一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用PCR扩增检测K-ras基因突变的方法及试剂盒。

背景技术

K-ras基因是重要的原癌基因，K-ras基因突变使ras蛋白一直处于激活状态，刺激细胞不断的生长或分化，最终导致细胞的恶性转化。大约30％的人类肿瘤细胞中出现K-ras基因突变。Bosetal分析了人体肿瘤中K-ras基因点突变的发生率，胰腺癌82％，结肠癌43％，肺癌30％c，甲状腺癌29％，膀胱、肝、肾和子宫癌10％或低于10％。Mok等报道交界瘤中，K-ras突变发生率为48％，突变分别发生于12号密码子及13号密码子。直结肠癌K-ras基因点突变率达40％-50％以上，且点突变几乎皆位于12，13，61号密码子，其中大多数点突变位于12号密码子。Pontieri-Lewis等研究证实约50％的大肠癌组织中检测出K-ras基因突变，其中约80％的点突变位于K-ras基因12号密码子，另约15％发生在K-ras基因13号密码子。K-ras基因突变的位点最常见于第12，13号密码子，可导致p21-ras蛋白的生长信号的异常变化。过度的生长信号可刺激细胞生长和增殖从而导致了癌症的发生。2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布了最新临床研究结果，即K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而K-ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10月，K-ras基因突变检测被写入最新版(2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出两点，一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态，二是只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。国家卫生部于2010年10月14日发表了《结直肠癌诊疗规范(2010版)》(卫办医政发(2010)165号)。该规范明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受爱必妥、帕尼单抗治疗前，必须检测肿瘤组织的K-ras基因状态。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)进行分子靶向治疗。综上所述检测K-ras基因突变的情况不仅仅有助于肿瘤的早期诊断及预防，也有利于肿瘤患者的临床治疗。准确且迅速的诊断出K-ras基因有无12，13号密码子突变对肿瘤的早期诊断及预后有着重要的意义。

目前，主要用于基因突变检测的方法包括如下几种：(1)利用单碱基变化产生新的或消除已有的内切酶识别位点；(2)利用单碱基变化造成的碱基互补性对引物延伸反应的影响；(3)利用单碱基变异对核酸分子杂交的影响；(4)利用单碱基变异对核酸分子在电场中迁移速度的影响；(5)直接测定单碱基变异。其中第一类的代表方法为限制性内切酶酶解片段长度多态性，这一方法具有简便、经济和十分可靠的特点，但这一方法的显著弱点是仅能用于研究小部分涉及了限制性内切酶酶解位点变化的突变，且该类方法难以直接应用于高通量平行分析。另一类种类繁多且获得广泛应用的突变检测方法，是碱基特异引物延伸反应，包括双向引物延伸反应，即应用碱基特异性引物与常规的多聚酶链式反应相结合、引物延伸反应与连接酶相结合、引物延伸反应与杂交分析相结合等。所有这些方法的共同点是使用了无校正功能的DNA聚合酶。上述不同方法所得的假阴性高低各不相同，但其共用的无校正功能的低保真聚合酶使所有这一类方法具有其结构上的缺陷，即无可避免地产生较高的假阳性。而目前常规使用的Sanger酶法测序即双脱氧核苷酸介导的单碱基延伸反应，对突变含量较低的相嵌体、突变较少的线粒体异质体、体细胞突变和频态分布较低的DNA池分析均难以应用。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒，通过采用一组特异性PCR引物对待测样本进行扩增，检测是否产生扩增产物条带，以及条带的大小判断K-ras基因型，可快速、准确、简便、经济地判断待测样本是否存在K-ras基因的3个热点突变：12号密码子GGT-GAT，GGT-GTT，13号密码子GGC-GAC。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种检测K-ras基因突变的试剂盒，包括：常规PCR组件，还包括特异性引物；所述特异性引物包括三条正向引物和一条反向引物，其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示：