[发明专利]一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测K-ras基因突变的试剂盒，包括：常规PCR组件，其特征在于，还包括特异性引物；所述特异性引物包括三条正向引物和一条反向引物，并且每一条正向引物的三末端第二个碱基为硫化修饰碱基；其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示：

SEQ ID No.1：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGAT-3’；

SEQ ID No.2：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGTT-3’；

SEQ ID No.3：5’-TGGTAGTTGGAGCTGGTGAC-3’；

SEQ ID No.4：5’-TCTGTATCAAAGAATGGTCC-3’；

所述常规PCR组件包括：高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNTPs。

2.根据权利要求1所述检测K-ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述检测K-ras基因突变的试剂盒还包括三个检测位点的阳性对照突变质粒，所述三个检测位点的阳性对照突变质粒分别为：pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因12号密码子GGT-GAT的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因12号密码子GGT-GTT的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因13号密码子GGC-GAC的突变序列。

3.采用权利要求1所述检测K-ras基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在K-ras基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用常规方法提取待测组织样本基因组DNA或外周血游离DNA；

(2)以步骤(1)所得样本基因组DNA或外周血游离DNA为模板，采用特异性引物进行多重PCR扩增，根据PCR扩增的结果判断样本中是否含有K-ras基因的3个热点突变中的至少一种；判断规则为：如果出现扩增产物，则表明样本中含有上述3个热点突变中的至少一种；如果没有出现扩增产物，则表明样本中不含上述3个热点突变中的任意一种；所述3个热点突变为：12号密码子GGT-GAT突变，12号密码子GGT-GTT突变，13号密码子GGC-GAC突变。

4.根据权利要求3所述检测K-ras基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在K-ras基因突变的方法，其特征在于，进行多重PCR扩增时，每25μL的多重PCR扩增体系包括：1μL模板，2.5μL 10×含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1.5μL反向引物，三条正向引物各0.5μL，0.2μL Pfu酶，0.4μL dNTPs，剩下加水补足；多重PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，68℃退火20秒，退火温度每个循环递减1℃，72℃延伸30秒，共10个循环；95℃变性20秒，59℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

5.如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

6.如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。

7.如SEQ ID No.3所述的核苷酸序列。

8.如SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。