[发明专利]一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1,5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法和试剂盒。 

背景技术

1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)，又名2-脱氧葡萄糖、1，5-脱水山梨醇。临床资料表明，血清1，5-AG的监测可确切地反映较短期内糖尿病的控制程度，是糖尿病监护中的良好指标。 

自1，5-脱水葡糖醇对糖尿病的诊断意义被临床所认识以来，已有阴离子交换层析法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质谱法(LC-MS)、吡喃糖氧化酶分析法等诸多方法应用于血清1，5-AG的测定。前三种方法需要对1，5-AG进行衍生和复杂的样品前处理，同时需特殊、昂贵仪器，不适合临床常规分析。吡喃糖氧化酶分析法虽好，但测定试剂的稳定性普遍较差，难以在临床推广应用。 

申请者研究发现，要开发稳定的液体型血清1，5-AG吡喃糖氧化酶法测定试剂，应重点建立一种快速清除高浓度葡萄糖的方法，以消除葡萄糖对1，5-AG测定的干扰。Fukumura Y(Clin Chem，1994，40：2013-2016.)、陈国军(中华医学检验杂志，1999，22(6)：358-361.)、第一化学药品株式会社(中国专利申请号97126042.7)武汉埃克玛生物技术有限公司(中国专利申请号99116563.2)等在测定1，5-AG时，将葡萄糖通过酶法途径转化为6-磷酸葡萄糖，但生成的6-磷酸葡萄糖在丙酮酸激酶等含量不足时可重新转化为葡萄糖，即使引入ATP再生系统也无法避免葡萄糖对1，5-AG测定的干扰。冯景(检验医学，2005，20(6)：551-514.)等将葡萄糖转化为不与吡喃糖氧化酶反应的6-磷酸葡萄糖内酯，该酶法转化途径需要高浓度的三磷酸腺苷(ATP)以确保葡萄糖向6-磷酸葡萄糖内酯转化，反应过程中生成的二磷酸腺苷(ADP)对该转化途径存在反馈抑制，不利于高浓度的葡萄糖清除， 另外实验发现该测定试剂存储过程中ATP的逐步分解直接导致葡萄糖清除能力的降低，从而给制备液体型稳定试剂带来困难。协和梅迪克斯株式会社(中国专利申请号99124799.X)在将葡萄糖转化为果糖-1，6-二磷酸，同时使1，5-脱水葡糖醇转化为1，5-脱水葡糖醇-6磷酸，然后再用1，5-脱水葡糖醇-6磷酸脱氢酶系对1，5-脱水葡糖醇-6磷酸进行定量测定。由于吡喃糖氧化酶对1，5-脱水葡糖醇-6磷酸不产生任何氧化作用，因此该葡萄糖消除方法无法应用于1，5-脱水葡糖醇的吡喃糖氧化酶法测定。 

本发明的目的是为了解决上述技术的不足，建立一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法。在测定血清1，5-AG前，将葡萄糖转化为不与吡喃糖氧化酶反应的6-磷酸葡萄糖内酯，并使反应中生成的ADP在PEP的存在下经PK作用重新转化为ATP，体系中仅需0.5mmol/LATP就可使60mmol/L的葡萄糖在180s内完全转化为6-磷酸葡萄糖内酯。依据该法构建的葡萄糖清除试剂置2-8℃保存可稳定14个月，可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的快速清除高浓度葡萄糖的方法。 

一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的快速清除高浓度葡萄糖的方法，包括：配制pH6.0-9.0的2-玛啡琳乙基磺酸(MES)缓冲液，其中含有一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)和ATP，加入含葡萄糖(Glu)的血清样本，并于20-50℃反应3-5分钟。其中血清样本和葡萄糖清除试剂的体积比控制在1/10-1/200，可以获得很好的测试结果。在ATP存在下，GK将Glu转化为葡萄糖-6-磷酸(G6P)，同时生成二磷酸腺苷(ADP)；在NADP+存在下，G6PD进一步把G6P转化为6-磷酸葡萄糖内酯(G6PL)；反应中生成的ADP在PEP的存在下经PK作用重新转化为ATP。上述反应后可加入含4- 氨基安替比林(4-AAP)、PROD、过氧化物酶(HRP)、3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸(TBHBA)的显色剂进行显色。所述显色剂中各组分的最适含量为4-氨基安替比林(4-AAP)2mmol/L、PROD 50KU/L、过氧化物酶(HRP)6KU/L和3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸(TBHBA)2.0mmol/L。