[发明专利]麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗及制备工艺

说明书

技术领域

本发明公开一种麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗及制备工艺，是对该疫苗现有制备工艺的改进，属于疫苗制备方法技术领域。

背景技术

麻疹病毒属副粘病毒科麻疹病毒属（morbillivirus），与其它副粘病毒不同之处为无特定的神经氨酸酶活力。麻疹病毒属单股负链核糖核酸（RNA）病毒，外壳脂蛋白包膜上有短小突起，带血凝素，可凝集猴红血球。此病毒可在人二倍体细胞、人羊膜细胞、狗肾细胞、鸡胚细胞等多种细胞上培养增殖。从1965年国家批准生产麻疹减毒活疫苗开始，各厂家均用鸡胚（CEC）细胞生产，病毒培养容器为转瓶或静止培养，收获病毒方式为原液一次收获。此疫苗问世四十多年，但从未有厂家改变其疫苗的生产基质和培养及收获方式。

用鸡胚（CEC）细胞生产麻疹减毒活疫苗，多年来就有潜在外源因子（禽病毒）危险的争论和对鸡蛋过敏者不能接种的局限性。病毒的培养方式在六、七十年代就已确定。转瓶生产有着转机机械故障导致生产损失的必然，静止培养有着对培养室的面积要求和收获的局限性，同时收获的病毒原液也因存在批间差而失去均一性（因病毒培养后为以一次性以原液方式获取，并根据培养细胞的病变程度，收获病毒原液）。另一点原代细胞的获取操作比较麻烦及耗材大，但上述操作方法却被各生产厂家一直延续至今。

发明内容

本发明公开麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗的制备工艺，旨在解决用鸡胚（CEC）生产存在外源因子污染和一小部分人存在过敏反应的可能及解决了生产效率和质量不高的问题。

本发明公开的麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗制备工艺，包括以下步骤：

1）将人胚肺二倍体细胞按1：2—1：4比例传代至细胞工厂，E-MEM培养液的pH为7.2~7.6、牛血清含量为10~15%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的30~40%；同时，长-47株麻疹病毒以1：（100~1000）的感染复数加入细胞工厂中，33℃培养细胞及病毒；

2）当细胞出现50~60%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以培养液2-3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液；加入199疫苗液，加入量为每层细胞工厂体积的25~40%，33℃继续培养；重复三次，收获病毒液；

3）将三次收获的病毒液保存于（2~8）℃，待无菌试验合格后，将疫苗液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5~10倍，保存于（2~8）℃或（-25~-20）℃。

所述的麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗制备工艺，还可以通过以下步骤实现：

1）将人胚肺二倍体细胞按1：2—1：4比例传代传至细胞工厂，E-MEM培养液的pH为7.2~7.6、牛血清含量为10～15%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的30~40%；37℃培养3-5天，对人胚肺二倍体细胞进行传代；

2）长-47株麻疹病毒以1：（100~1000）的感染复数加入已形成细胞单层的细胞工厂中，33℃培养病毒；

3）当细胞出现50~60%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以培养液2-3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液；加入199疫苗液，加入量为每层细胞工厂体积的25~40%，33℃继续培养；当细胞病变出现75%开始进行收毒，收获病毒液，重复三次；

4）将三次收获的疫苗液保存于（2~8）℃，待无菌试验合格后，将疫苗液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5~10倍，保存于（2~8）℃或（-25~-20）℃。

在上述的麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗制备工艺中，所述的人胚肺二倍体细胞可以选择2BS株或KMB-17或MRC-5中的任一种。