[发明专利]啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及类病毒的检测技术，具体涉及涉及啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂及检测方法。

背景技术

啤酒花潜隐类病毒（Hop latent viroid，HpLVd）隶属于Cocadviroid属，分布于英国、德国、韩国、波兰、日本、捷克、巴西、美国、中国新疆等国家和地区的啤酒花上。该类病毒侵染啤酒花后一般不表现明显的症状，但会改变其一些次生代谢产物成分，从而影响啤酒花品质，降低啤酒花产量。Adams等报道，不同啤酒花品种受HpLVd侵染后，a-酸的含量降低20%～50%；受HpLVd侵染的啤酒花球果产量降低11%。

目前国内外检测啤酒花潜隐类病毒的方法主要是分子杂交法；分子杂交法的前提是要制备探针，较为复杂，且检测步骤繁琐。近年来，利用TaqMan-MGB探针进行实时荧光RT-PCR反应是在常规RT-PCR反应体系中添加了1条TaqMan-MGB探针；探针的5'端含有报告荧光基团，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，进行PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。目前实时荧光PCR技术已广泛用于病毒检测、细菌检测、植原体检测、转基因产品检测、线虫检测等诸多领域，但对啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测尚未见公开报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测啤酒花潜隐类病毒的检测试剂及方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是提供一种检测啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为61bp，引物和探针序列为：

引物HLV-F： 5'-CGTGGAACGG CTCCTTCTT-3'；

引物HLV-R：5'-AGAGTTGTAT CCACCGGGTA GTTT-3'；

探针HLV-P：5'-CACCAGCCGG AGTT-3'，该探针的5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子；扩增目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是提供一种能简单、快速、灵敏、准确地检测啤酒花潜隐类病毒的方法，是以啤酒花样品总RNA为模板，用上述检测啤酒花潜隐类病毒的引物和探针进行实时荧光RT-PCR，检测扩增产物荧光信号；

所述啤酒花样品可为啤酒花幼苗、叶片和球果；

上述方法中，如从扩增产物中可检测到荧光信号，说明所述检测样品含有啤酒花潜隐类病毒，而且可以根据Ct（循环阈值）的大小确定样品中的起始模板的量；

所述啤酒花样品经RNA提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取植物总RNA，得到总RNA模板，具体操作见试剂盒说明书；

所述实时荧光RT-PCR反应是以提取样品总RNA为模板，25μL反应体系中Mg²⁺终浓度为5.5mM、引物HLV-F和HLV-R的终浓度都为0.7μM、探针HLV-P终浓度为0.5μM、2xQuantiTect Probe RT-PCR Master Mix（含终浓度4.0 mM的Mg²⁺、购自Qiagen公司）为12.5 μL、QuantiTect RT Mix（购自Qiagen公司）为0.25μL，RNA（20 ng/μL~200 ng/μL）为1μL，RNase Free dH₂O补至25μL；所述实时荧光RT-PCR的反应条件为：50℃ 30 min；95℃ 15 min；然后94℃ 15 s，60℃ 60 s，共40个循环。反应体系也可以为50μL等。 

本发明针对现有啤酒花潜隐类病毒检测方法费时、繁琐等缺点，提供了一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。本发明方法中实时荧光RT-PCR检测试剂的专用引物和探针对啤酒花潜隐类病毒具有很强的专化性，并通过对反应体系的优化，不仅能提高啤酒花潜隐类病毒检测的效果，还能对受检样品进行定量分析。