[发明专利]荧光定量PCR对布鲁氏杆菌气溶胶的快速鉴定方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及荧光定量PCR对布鲁氏杆菌气溶胶的快速鉴定方法。

（二）发明背景

布鲁氏菌病(Brucellosis) 是由布鲁氏菌 (Brucella)引起的一种全世界广泛分布的人兽共患慢性细菌性传染病。布鲁氏菌可感染人类、多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状与病理损伤，如发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。

本病流行于世界各地，1887年首次证实本病病原体，20世纪30～60年代布鲁氏菌病在世界范围内已有较流大行[1]，80年代全世界200多个国家和地区约170多个国家和地区有人、家畜、野生动物布鲁氏菌病的存在和流行[2-3]，约有全世界1/6～1/5的人口受到布鲁氏菌病的威胁，全世界现约有500 万～600 万人患布鲁菌病，每年新发病人约有 50 万人，分布相当广泛，其中欧洲是一个布鲁氏菌病发病率最高的洲。在亚洲的发病率以伊朗最为严重，人间发病较高，在家畜中布鲁氏菌病流行也很严重，几乎各种家畜都有布病流行，老挝人间布鲁氏菌病也属于高发区，在牛、羊、猪中都有布鲁氏菌病流行，蒙古人民共和国人畜布鲁氏菌病都比较严重[4-8]。

我国也是布鲁氏菌病疫区，近几年来疫情回升。据1952年～1990年的资料统计，1952年～1982年间对总共3050万头羊、牛、猪和457万份人血清样品调查表明，布鲁氏菌感染阳性率家畜和人分别为41.27%和8.43%，而1982年～1990年间总共4920万头羊、牛、猪和788万人血清学调查表明，布鲁氏菌感染阳性率家畜和人分别骤降至0.55%和0.75%[9]。但自1993年后，我国布鲁氏菌病疫情又呈上升趋势，爆发点不断出现，1994年新发病人数为815人，到2003年新发病人数已达6000多人[10]，2006年报告病例20279人，是我国发病人数最多的一年。布鲁氏菌病疫情回升的省区有黑龙江、吉林、辽宁、山东、河北、河南、山西、陕西、新疆、西藏、内蒙古等。如陕西省缓德县，1995年新发病人286人，发病率高达84.8/10万，血清效价最高达1:25600[11]，河北省布鲁氏菌病发病率从1997年的0.134/10万[12]，逐年上升为2001年的0.415/10万[13]。另外疫区不断蔓廷，老疫区发病增加，新疫区不断出现，以河北省为例，疫区从1997年的7市17县区发展到2001年的8市33个县区[12-16]。

并且，我国对人布鲁氏菌病疫情监测亦表明，80年代前牧民、兽医、屠宰场和皮毛场的工人、饲养员等职业人群的感染率在10.00-20.00%之间，其它非职业人群仅为0.50-4.50%，80年代后，上述职业人群感染率都低于5.00%(个别除外)，而其它非职业人群如农民、干部、学生的布鲁氏菌病感染率上升为2.30-4.70%之间，说明非职业人群的布鲁氏菌病感染率呈上升趋势[17]。

鉴于布鲁氏菌病有反弹的趋势，在未来一段很长的时间里，布鲁氏菌病仍将是世界性的公共卫生问题，我国的布鲁氏菌病防制也仍面临着巨大的挑战。因此，对布鲁氏菌病的流行及防控的研究势在必行。

然而，病原的特殊性和复杂性导致了布鲁氏菌的基础研究严重滞后，国内外大部分研究仅仅对发病疫区布鲁氏菌进行分离鉴定和分型，对感染布鲁氏菌病的动物进行隔离或捕杀，对易感动物进行疫苗免疫。有关布鲁氏菌的传播机制的研究主要集中在接触性传播和垂直性传播上，对气源性传播的报道很少，理论上认为布鲁氏菌可以通过气源性传播，但是迄今为止，尚未见到对布鲁氏菌进行气源性传播的相关研究。

基于上述国际、国内研究现状的分析，本发明主要围绕布鲁氏菌气源性传播，首先对我国牛场进行布鲁氏菌的流行病学调查；然后在发病牛场及其上风向、下风向不同距离的地方采集空气样品，利用分子生物学技术（real-time PCR）检测布鲁氏菌的含量及分布情况。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明建立了灵敏度高、特异性强、重复性良好、操作简单、快速的B.abortus的气源性传播的real-time PCR快速鉴定，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。

本发明的具体步骤是：

1、引物设计