[发明专利]荧光定量PCR对布鲁氏杆菌气溶胶的快速鉴定方法

权利要求书

1.一种荧光定量PCR对布鲁氏杆菌气溶胶的快速鉴定方法，包括引物设计、病原DNA的提取、B．abortus IS711和AlkB基因的扩增、制备质粒标准阳性模板和绘制Real-time PCR标准曲线；其特征在于包括以下步骤：

1）引物设计

利用Premier v.5.0（PREMIER Biosoftware International, Palo Alto, CA, USA）软件对Brucella abortus strain 544基因组中IS711和AlkB基因的保守区域设计一对引物和探针，扩增DNA产物148bp；

上游引物：5’－ATGCCTGCCTCATCAATCGTTA－3’ 其序列如Seq ID No：1所示；

下游引物：5’－GGGTCCGTCCGTTTCATTCC－3’ 其序列如Seq ID No：2所示；

Taqman probe：5’-FAM-CGCTCCATCAGGACAAGGACGAACGG-ECLIPSE-3’ 其序列如Seq ID No：3所示；

2）取备检样品提取B. abortus基因组DNA；

3）扩增B．abortus IS711和AlkB基因

以提取的B．abortus DNA作为模板，应用引物进行扩增；在反应管中依次加入10×PCR buffer 2.5μl，dNTP1.6μl，上、下游引物分别为1.6μl，Taq酶0.2μl，超纯水15.5μl，DNA提取液2.0μl，总体积25μl；在PCR仪上置94℃5分钟，随后94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，共35个循环，结束循环后72℃10分钟；对PCR产物进行琼脂凝胶电泳鉴定；然后按照通用型DNA纯化回收试剂盒的说明进行切胶回收；

4）制备质粒标准阳性模板

① 确定阳性质粒：PCR产物于1%琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，菌液PCR鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准菌株序列对比分析，确定阳性质粒； 所述的荧光定量标准品为B．abortus IS711和AlkB基因，序列大小为148bp,其序列如Seq ID No：4所示；

② 阳性质粒浓度的测定：将阳性质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260 nm与280 nm波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数；

         质粒DNA拷贝数=                                                

             注：每个碱基的平均分子量为660

5）Real-time PCR标准曲线的绘制

提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释（10⁶ ～10¹ copies/μL）用于荧光定量PCR标准曲线绘制；扩增反应体系10 μl：每个反应管中加入Probe0.25μl，上下游引物分别为0.45μl，模板2 μl，超纯水1.85μl，TOYOBO Master mix（2×）5μl, 总体积10μl；反应条件为：先置50℃2分钟，接着置95℃10分钟，随后95℃15秒，60℃1分钟，共40个循环，数据的收集和标准曲线的生成由仪器自带软件SDSV1.9.1完成；根据待测样品中目的基因的拷贝数，便可以推导出奶牛舍环境中气载B．abortus的浓度Copies/m³ air。