[发明专利]白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法

说明书

技术领域

    本发明涉及食用菌杂种的鉴定方法，具体涉及白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法。

背景技术

    白灵菇是白灵侧耳的商品名称，又名翅鲍菇、白灵芝菇、克什米尔神菇等，其分布与新疆阿魏（Ferula sinkiangensin K.M.Shen）的分布密切相关，仅分布在我国新疆的阿尔泰、托里、木垒、塔城等地有新疆阿魏生长的荒滩，分布海拔高度在720—1000m，其基因资源有限。杏鲍菇 (Pleurotus eryngii (DC.:Fr.) Quél)发生于伞形花科刺芹属，刺芹枯死的植株上，在我国新疆、青海、四川西部有自然分布，基因资源较白灵菇丰富。

白灵菇和杏鲍菇不仅有很高的营养价值，口感风味好，而且还有很高的药用价值，市场前景广阔。但白灵菇的组织致密性、口感、朵形颜色优于杏鲍菇，而风味、生长周期、生物转化率和生产管理条件劣于杏鲍菇，因此，可以应用生物技术将两者的基因融合在一起，从而获得具有白灵菇与杏鲍菇特性的杂交种，筛选出优良的杂交种，增加市场上白灵菇的品种，促进白灵菇产业的发展。

为了快速筛选白灵菇与杏鲍菇的杂交种，有必要探索鉴定白灵菇与杏鲍菇杂交种的真伪。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，为有效鉴定白灵菇与杏鲍菇杂交种的真伪提供便捷的方法，进而在白灵菇与杏鲍菇的杂种中筛选出优良的杂交种，从而缩短白灵菇的育种进程。     。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：本发明的白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，包括白灵菇与杏鲍菇亲本菌株选择、原生质体制备、原生质体融合、菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测；其特征在于：

1、特异酶切片段标记的产生：在8～12 μL ITS-PCR扩增产物, 加入2μL EcoO109I酶的酶切Buffer，0.8～1.2 μL EcoO109I酶, 5～ 9.8μL ddH₂O，37℃水浴4～7 h；所述EcoO109I酶的酶切Buffer成份为100mmol/L  Tris-HCl,  pH7.5，100mmol/L  MgCl₂，10 mmol/L  Dithiothreitol；

2、酶切产物的电泳检测：取EcoO109I酶的酶切产物15μL，与3μL上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳；经电泳检测，在一个泳道上只有同时出现分子量为675～685bp、435～445 bp和235～245bp的DNA标记条带，是白灵菇与杏鲍菇杂交种的标记；所述上样缓冲液：0.1％ 溴酚蓝, 40% 蔗糖。

本发明具有以下优点：本发明的白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，具有检测时间短、准确性高、容易判断、稳定性好等优点。

1、检测时间短：该检测所需时间短，一般只需要10～15天，比通过出菇获得子实体形态鉴定至少省40天以上。

2、准确性高、稳定性好：本发明以基因组DNA为材料，DNA是稳定的遗传物质，是区分物种的本质表现所在，而DNA序列中的保守序列更是稳定，是物种长期进化的分子标记，不易受外界因素等的影响，因此以保守序列开发的鉴定技术准确性高，稳定性好。

3、专一性强：本发明充分利用酶的专一性和高效性，且本发明使用的酶对白灵菇和杏鲍菇的杂种具有特异性，产生特异识别性的标记片段，非此杂种得不到这种效果。

4、容易判断：本发明的判断依据是在琼脂糖电泳上出现的特异DNA标记条带，DNA标记条带少、清晰，一目了然。         

附图说明

图1为EcoO109I酶的酶切电泳图；其中，M～3为泳道编号；左侧的数字和右侧的数字表示DNA片段的分子量。图1中，1～3泳道分子量为678bp，440 bp和237 bp的DNA标记条带，是白灵菇与杏鲍菇杂交种的标记。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的阐述。

一种白灵菇与杏鲍菇杂种的分子标记鉴定方法，包括以下步骤：

1、白灵菇与杏鲍菇亲本菌株选择、原生质体制备、原生质体融合：

选取优质、高产的白灵菇菌株和杏鲍菇菌株作为杂交亲本；