[发明专利]一种可高效在体内外转染基因的新型脂质体及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可高效在体内外转染基因的新型脂质体及其制备方法。

背景技术：

转染基因就是把外源基因导入到活体细胞的一种方法，是研究蛋白质基因调控，信号传导以及基因治疗等最重要的基本环节之一。

目前常用的转染方法有钙磷转染法、电穿孔法、显微注射法和脂质体法等方法。钙磷转染法是将正常基因DNA(及其拷贝)与带电荷物质和磷酸钙、DEAE-葡萄糖或与若干脂类混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，直接倾入培养基中与细胞接触的转染方法。这种方法简单，但效率极低，进入细胞的DNA只有1％-5％可以进入细胞核，其中只有不到1％的DNA可以与细胞DNA整合，另外其重复性不佳，易受pH值、钙离子浓度等影响。电穿孔法是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，周围基质中的DNA可渗进细胞。这种方法转染率较高，但需要昂贵的仪器设备(电穿孔仪)，不同细胞需要不同的操作程序，细胞损伤也较为严重，容易引起细胞死亡，不适用体内转染，无法应用到体内基因治疗。显微注射法是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法是有效的，但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时，此法用于生殖细胞时，有效率较高，但直接用于体细胞却很困难，也不能用于体内转染和基因治疗。脂质体法是应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合导入基因，是目前应用较为广泛的方法。

脂质体作为新型药物输运载体具有多方面的优点，当药物被包封后，可降低药物毒性，减少药物用量，可进行靶向给药，提高药物疗效。目前市场上流通的脂质体制剂较多，但在某些肿瘤细胞或正常细胞中转染效率较低，在体内效果更差，较难应用于动物体内转染研究，而且作为载体，目前使用的脂质体靶向分布不理想，稳定性较差。

发明内容：

本发明的目的是提供一种转染效率高，转染细胞谱广，体内转染效率高，特别具有高效肿瘤靶向特性的可高效在体内外转染基因的新型脂质体及其制备方法。

本发明的可高效在体内外转染基因的新型脂质体是通过以下方法制备的，该方法包括以下步骤：

按磷脂酰胆碱与胆固醇的摩尔比例为1-2∶1称取磷脂酰胆碱与胆固醇，用磷脂酰胆碱质量1/8～1/2的氯仿作为溶剂溶解磷脂酰胆碱与胆固醇，将上述溶液置于旋转烧瓶中，旋转烧瓶使其混合均匀，再用真空抽吸器吸干溶剂，得到一层附着在烧瓶壁上的脂膜；然后再用按1/15～1/2ml/g磷脂酰胆碱的量加入质量分数为5％的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋转真空干燥，然后再加入双蒸水至上述质量分数为5％的葡萄糖溶液的体积，在50℃的超声水浴箱中进行超声处理1～3min，再在50℃下收集通过0.1μm的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体，即为可高效在体内外转染基因的新型脂质体。

优选，所述的磷脂酰胆碱与胆固醇的摩尔比例优选为1.7∶1，所述的氯仿的用量为磷脂酰胆碱质量的1/4，所述的加入质量分数为5％的葡萄糖溶液的量为按8.9/100ml/g磷脂酰胆碱，所述的再在50℃下收集通过0.1μm的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体是在50℃下依次通过1.0μm，0.45μm，0.22μm，0.1μm的滤膜，最后收集通过0.1μm的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体。

可将本发明的可高效在体内外转染基因的新型脂质体放入洁净的玻璃瓶中，用氮气填充试管，将脂质体保存于试管中置于4℃避光保存。

本发明人经过反复实验探索，利用磷脂酰胆碱与胆固醇的摩尔比例为1～2∶1作为脂质体的磷脂和胆固醇的比例，模拟人体细胞膜脂质体和胆固醇比例，使得该脂质体具有更好的生物相容性，再通过本发明的方法制备，利用超声波仪处理和挤压使脂质体通过固定粒径的聚碳酸酯膜，得到合适粒径的脂质体。该脂质体直径适当，平均直径约为180nm，容许其穿透极细的毛细血管并被细胞摄取。脂质体与基因或质粒包裹后，平均直径为250(200～300)nm。在体外，可高效转染各种人体和小鼠细胞，在293细胞中，其转染率高达80％-90％。在乳腺癌细胞系、卵巢癌细胞系和胰腺癌细胞系等，其转染率可达到30％-50％。在体内，易穿过肿瘤毛细血管壁，可在肿瘤部位富集靶向肿瘤细胞，使其产生高效转染。因此，本发明的可高效在体内外转染基因的新型脂质体具有转染效率高，转染细胞谱广，体内转染效率高，特别具有高效肿瘤靶向性的特性，使其应用更广泛，特别适合应用于体内转染和基因治疗等研究。

附图说明：