本发明公开了一种小麦骨干亲本染色体中心区祖系单倍群骨架特异性引物对及其开发方法。该特异性引物包括如下至少一对引物对:序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对,序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物对,序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物对,序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物对,序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物对等。采用该特异性引物对对待测小麦的基因组DNA进行扩增,扩增产物与目标长度相同还是不同,能够确定待测小麦的染色体骨架类型。