[发明专利]一种布鲁氏菌菌壳及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种布鲁氏菌菌壳及其制备方法和应用。

背景技术

布鲁氏菌(Brucella spp.)是一种胞内寄生、人兽共患病原菌，而布鲁氏菌病(布病)是指由布鲁氏菌引起的一种流行广泛、传染性强、危害极大、感染后难以根治的人兽共患传染病。动物布病主要症状为发热、流产、不育、慢性关节炎及神经损害等，能引起怀孕的雌性动物在怀孕后期流产，以及雄性动物的睾丸炎和附睾炎等；人布病主要通过皮肤粘膜、消化道和呼吸道感染，其临床表现为长期发热，伴有多汗、关节痛、肝脾肿大以及生殖系统损伤等。人感染布鲁氏菌后，需要长时间的抗生素治疗，而且往往会留下较严重的后遗症。

感染的家畜是人布病的主要传染源，人主要通过接触患病的牲畜及其产品或其污染物而感染布病。布病不仅严重危害着人类和动物健康，同时影响畜牧业、旅游业、国际贸易及经济发展。该病在世界各地都有广泛流行，每年因此造成的经济损失高达数十亿美元。布病在我国流行范围广、危害严重，自新中国成立后开展了全面而系统的防治，有效地控制了布病的发生和流行。然而，从上世纪90年代以来，我国人与动物布病的发病率又有明显上升的趋势。

当前使用的布鲁氏菌疫苗多为弱毒疫苗，这类疫苗虽然具有一定的免疫保护效果，但也具有非常明显的缺点，即毒性大，返祖现象严重，会对人与动物机体造成伤害，甚至发病。因此研制一种具有良好保护效果和安全性的布鲁氏菌疫苗具有重要的实际意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌菌壳及其制备方法和应用，使所述布鲁氏菌菌壳具有良好的安全性和保护效果，优于现有弱毒疫苗。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种布鲁氏菌菌壳的制备方法，包括：

步骤1、将如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的裂解基因E克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220::E；

步骤2、用如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的正向引物BRU1和如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的反向引物BRU2扩增重组质粒pBV220::E，将扩增后的产物连接到质粒pBBR1MCS-2中SpeI和SalI酶切位点之间，得到重组质粒pBBR1MCS-2-E；

步骤3、重组质粒pBBR1MCS-2-E转化到布鲁氏菌菌株中得到重组菌株，将重组菌株在25-30℃进行繁殖培养至其OD₆₀₀值为1.0后迅速升温至37-45℃进行诱导培养至其OD₆₀₀值稳定，然后离心收集菌体，洗涤后用高渗溶液冻融即得。

菌壳(Bacterial ghosts，BG)是一种新型细菌疫苗，通常是由PhiX174噬菌体的裂解蛋白E在细菌表面形成跨膜孔状结构。噬菌体PhiX174的E基因编码一个由91个氨基酸组成的疏水性蛋白质，该蛋白可通过寡聚化起到连接细菌内、外膜的作用，从而形成一种孔状通道，孔状通道的直径介于40-200nm之间，其大小因细菌个体差异而不同，主要涉及细菌自溶发生的程度、肽聚糖层上筛孔的大小情况以及裂解过程中细胞膜所发生的变化。孔状通道一旦形成，在细胞内高渗透压的作用下，细菌内容物通过孔道排出，从而形成一个没有核酸、核糖体和其他胞内成分的细菌空壳。

菌壳是以非变性方法制备而成，完好地保留了细菌菌体和各种抗原结构，保持了细菌天然的外膜和天然表面抗原，外膜上有高免疫刺激性的脂多糖和肽聚糖等结构，这些细胞表面的有效成分可以被巨噬细胞或抗原递呈细胞所识别，进而激发有效的免疫反应过程。此外，菌壳自身还具有佐剂活性，经改造后可以作为疫苗载体。

因此，本发明采用合适的引物、质粒等，通过克隆、重组、转化等生物技术手段制备布鲁氏菌菌壳，由于布鲁氏菌内细胞内容物已经外泄，属于灭活疫苗，所以其安全性明显高于现有的弱毒疫苗。

其中，本发明所述布鲁氏菌优选为布鲁氏菌S2菌株(即猪种S2株)、布鲁氏菌M5菌株(即羊种M5株)、布鲁氏菌RB51菌株(即牛种RB51株)或布鲁氏菌104M菌株(即人用104M株)。