[发明专利]PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及新城疫DNA疫苗的制备方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性、致死性传染病，常呈败血症，是危害养禽业的最重要传染病之一，被国际兽医局定为I类传染病。控制ND最根本的措施是进行有效的疫苗接种，目前常用的疫苗是弱毒活疫苗和灭活疫苗，但二者在实际应用中均存在一定的局限性。ND油乳剂灭活疫苗通过注射免疫鸡体后可产生较高水平的血液循环抗体，但在抵抗呼吸道和消化道病原感染的黏膜系统中却有局限性，很难阻止病原通过黏膜组织侵入动物体内，且对已经进入细胞的病毒很难发挥作用；ND弱毒活疫苗虽然可以产生一定的黏膜免疫和体液免疫，但受免疫方法和途径影响，产生的循环抗体较低，维持期短。饮水免疫很容易造成疫苗被消化道降解，导致疫苗吸收效率低；滴鼻点眼也只能使疫苗在鼻腔内存在15min，致使疫苗不能有效进入机体激发有效的黏膜免疫；气雾免疫产生的黏膜免疫效果较好，但容易诱导慢性呼吸道疫病，且弱毒苗均不能产生较高的血清抗体等。

DNA疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内，在体内表达相应抗原刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，产生保护性免疫。目前，DNA疫苗大动物实验、人体临床实验结果表明：DNA疫苗存在着给药剂量较大，生物利用度低，免疫效果个体差异大，不够理想的缺点，极大地阻碍了DNA疫苗的研究进展。因此，如何提高新城疫疫苗的免疫效果，研制出既能产生较强的体液免疫抗体又能产生高效的局部黏膜免疫的新型疫苗已成为ND疫苗研究的焦点。

近年来随着新型材料学和制剂新技术的发展，迫切需要一种新的和改进的疫苗递送方法以降低传染病的死亡率。目前，制备载疫苗抗原纳米粒所采用的载体材料主要有天然高分子聚合物壳聚糖、明胶，合成聚合物PLA、PLGA等。目前，国外DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究发展十分迅速，取得了不少阶段性成果，有的已进入临床实验。国内DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究工作开展较少，尤其是新城疫DNA疫苗黏膜免疫递送系统的研究还尚未见有报道。

发明内容

本发明提供了PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒的制备方法。

本发明PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒按以下步骤制备：

一、称取40mg的聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入200μg新城疫病毒F48E9株的F基因DNA质粒，冰浴条件下超声乳化30s，得初乳液，然后加入2mL质量浓度为2％的聚乙烯醇，在冰浴条件下超声乳化60s，得复乳液；

二、将复乳液逐滴加入到10mL质量浓度为0.5％的聚乙烯醇中进行纳米粒固化并挥发多余的二氯甲烷，以500r/min匀速搅拌5h，得固化液；

三、取3000g固化液4℃离心15min，收集纳米粒，然后用ddH₂O洗涤3次，经真空冷冻干燥后即得PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒；其中步骤一中新城疫病毒F48E9株的F基因DNA质粒的浓度为0.5％；步骤一中超声乳化的功率均为50w。

本发明PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒具有巨大的应用潜力，本发明PLGA新城疫DNA疫苗纳米粒递送系统对新城疫DNA疫苗具有保护作用，提高细胞转运效率，提高免疫效果，可肌注、点眼，也可口服，诱导黏膜免疫等特点。同时，在保证药物作用的前提下，减少了给药剂量、减轻或避免了毒副反应、可延长免疫保护期，避免了多次反复给药，且载体材料PLGA本身无毒，生物相容性好，可生物降解，因而是一种具有广阔应用前景的新型载体疫苗。本发明为新城疫DNA疫苗在临床上广泛应用提供了一个免疫效果好和安全性能高的递药系统，将促进新城疫DNA疫苗在家禽养殖的实际应用；在此基础上可将该研究成果应用到更多的动物疫苗和药物体系中，届时用于预防、治疗、诊断动物和人的疾患，将拯救诸多病畜或病者的生命或延长其寿命，其经济效益和社会效益无疑是巨大的。