[发明专利]一种土壤微生物cDNA文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤微生物cDNA文库的构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

随着生物及信息技术的迅速发展，挖掘、克隆新基因、研究新基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。构建  cDNA  文库是功能基因组学研究的基本手段之一，其在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分，在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等生物地化循环中扮演着重要角色，土壤微生物的功能多样性也成为土壤生态学研究的热点问题。构建土壤微生物的cDNA文库则能够为深入分析土壤微生物功能多样性，包括不同环境条件下，土壤微生物中相关基因的表达、调控，以及此过程中的基因与基因、蛋白质与蛋白质的互作提供重要的基础。然而，由于土壤中的微生物包括细菌、放线菌和真菌等，它们所转录的mRNA各不相同，常规的方法需要我们利用特定的试剂盒提取土壤总mRNA，包括带poly(A)的(真菌和放线菌mRNA、少数细菌的一些mRNA)和不带poly(A)的(细菌mRNA)。在此基础上，分别针对这两种类型的mRNA，应用不同试剂盒分离各种mRNA，最后合并成用于cDNA文库构建的土壤总mRNA。此法不仅费时费力，而且由于操作过程繁琐容易出现RNA降解而导致实验失败。

    因此，开发一种快速、简单、高效的土壤微生物cDNA文库的构建方法，解决常规操作步骤复杂，RNA容易降解的问题，此法对于开展土壤微生物的功能多样性研究十分必要。鉴于此，发明人前期发明了一种土壤微生物DNA和总RNA的提取方法(申请号：201010548527.X)，通过此法并分离获得土壤微生物总RNA，本发明在此基础上，开发一种简单、高效的土壤cDNA文库的构建方法。

发明内容

本发明提供一种简单有效的土壤微生物cDNA文库的构建方法，利用该法获得的文库的容量大。

本发明的土壤微生物cDNA文库的构建方法，包括土壤微生物总RNA的提取、逆转录，5’端接头连接，3’端接头连接，PCR扩增，以及cDNA文库的构建，其特征在于：具体步骤包括如下：

（1）土壤微生物总RNA获得：提取获得土壤微生物基因组DNA和总RNA，再利用DNA酶去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA纯化后备用；

（2）总RNA的逆转录：总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit进行逆转录，逆转录获得的cDNA用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 、pH=5.2的醋酸钠溶液，于-20℃下沉淀12 h；

（3）cDNA 5’端接头连接：纯化后的cDNA 用碱性磷酸酶进行5’的去磷酸化反应，去磷酸化的cDNA与5’接头1进行连接，连接产物用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的的3M、pH=5.2的醋酸钠溶液，于-20℃下沉淀12h；其中接头1：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'，5’端经磷酸化修饰；

（4）cDNA 3’端接头连接：连有5’接头cDNA的3’端用T4多核苷激酶进行磷酸化反应，磷酸化反应后的cDNA与3’接头2进行连接；其中接头2： 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'；

（5）PCR扩增：分别连接有3’端和5’端接头的cDNA用接头的互补引物P1：5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' ，P2：5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3' 进行扩增，具体的反应参数为：95℃ 1 min，94℃ 1 min、65℃ 30sec、72℃ 2 min 30sec共30 cycles, 72℃ 10min，扩增后的产物再以相同的引物进行二次扩增；

（6）cDNA 文库构建：二次扩增的PCR产物经纯化后，与pMD-18 T载体进行连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得cDNA文库。

步骤（1）中利用DNA酶I去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA用RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒和MicroSpin S-400 HR spin column进行纯化。