[发明专利]一种土壤微生物cDNA文库的构建方法

权利要求书

1.一种土壤微生物cDNA文库的构建方法，包括土壤微生物总RNA的提取、逆转录，5’端接头连接，3’端接头连接，PCR扩增，以及cDNA文库的构建，其特征在于：具体步骤包括如下：

（1）土壤微生物总RNA获得：提取获得土壤微生物基因组DNA和总RNA，再利用DNA酶去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA纯化后备用；

（2）总RNA的逆转录：总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit进行逆转录，逆转录获得的cDNA用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 、pH=5.2的醋酸钠溶液，于-20℃下沉淀12 h；

（3）cDNA 5’端接头连接：纯化后的cDNA 用碱性磷酸酶进行5’的去磷酸化反应，去磷酸化的cDNA与5’接头1进行连接，连接产物用2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的的3M、pH=5.2的醋酸钠溶液，于-20℃下沉淀12h；其中接头1：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'，5’端经磷酸化修饰；

（4）cDNA 3’端接头连接：连有5’接头cDNA的3’端用T4多核苷激酶进行磷酸化反应，磷酸化反应后的cDNA与3’接头2进行连接；其中接头2： 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'；

（5）PCR扩增：分别连接有3’端和5’端接头的cDNA用接头的互补引物P1：5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3' ，P2：5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3' 进行扩增，具体的反应参数为：95℃ 1 min，94℃ 1 min、65℃ 30sec、72℃ 2 min 30sec共30 cycles, 72℃ 10min，扩增后的产物再以相同的引物进行二次扩增；

（6）cDNA 文库构建：二次扩增的PCR产物经纯化后，与pMD-18 T载体进行连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得cDNA文库。

2.根据权利要求1所述的土壤微生物cDNA文库的构建方法，其特征在于：步骤（1）中利用DNA酶I去除基因组DNA后获得总RNA，总RNA用RNAPure高纯总RNA快速提取试剂盒和MicroSpin S-400 HR spin column进行纯化。