[发明专利]人残耳软骨干细胞及其构建组织工程软骨的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及利用人残耳软骨干细胞构建的组织工程化软骨及其制备方法和用途。

背景技术

小耳畸形(microtia)是一种发病率较高(约1/3000)的先天性疾病，表现为耳廓标志形态缺失，耳区被挛缩、畸形的软骨团块(残耳软骨)所取代。目前临床上对小耳畸形的治疗主要是取患者自体肋软骨雕刻成耳廓形态后植入耳区皮下为主。该方法的主要缺点是对正常肋软骨造成很大创伤，而且容易导致气胸、胸廓塌陷、畸形和瘢痕等供区并发症。

组织工程技术的兴起及迅速发展为解决这一难题带来了希望。目前应用动物的软骨细胞复合耳廓形态可降解支架已能在体外构建出精确的人耳廓形态软骨。因此，只要有足够的病人自体来源的软骨构建种子细胞，这一技术完全有希望转化为实际的临床应用，为小耳畸形患者的外耳重建带来福音。

然而，种子细胞来源问题一直是制约这一技术向临床转化的瓶颈。目前用于构建软骨的种子细胞主要有两种：1)软骨细胞；2)具有软骨分化潜能的干细胞。由于软骨细胞本身已经具有很强的自发成软骨能力，因此直接用其构建组织工程软骨最稳定也最能保证成功率；但正常人体内的软骨细胞来源非常有限，取材创伤大，且正常软骨细胞体外扩增能力很低，扩增后又极易老化、去分化，从而丧失软骨形成能力，因此，取病人自体正常软骨细胞进行外耳软骨重建缺乏临床应用可行性。具有成软骨分化潜能的干细胞(如脂肪干细胞或骨髓基质干细胞)虽然来源广泛，扩增能力强，但这些细胞体外构建具有特定形态(如人耳廓)软骨的成功率不高，且体外构建的软骨植入皮下环境后很不稳定，极易发生骨化或纤维化，也不适于构建耳廓等异位软骨。

小耳畸形患者的残耳在外耳再造手术中属于废弃组织，切取残耳不会对正常组织造成任何损伤，并且已有研究证实：早期传代的残耳软骨细胞能够再生组织工程软骨。那么，能否利用小耳畸形病人自体的残耳软骨细胞构建耳廓形态软骨来进行耳再造呢？要实现这一梦想，首先要解决三个关键问题：1.细胞数量问题：一个病人的残耳软骨中仅能分离获得1-3×10⁶个细胞，能否将这些细胞扩增到构建正常大小人耳廓形态软骨所需的细胞数量(1.5-3×10⁸个细胞)？2.细胞功能问题：扩增后的残耳软骨细胞是否还具有良好的软骨形成能力？3.构建技术问题：如何利用这些细胞在体外构建具有精确人耳廓形态的软骨？

综上所述，本领域迫切需要寻找取材创伤小，具有较强增殖能力和软骨形成能力，且在皮下环境中软骨形成稳定的种子细胞，并建立相应的软骨构建核心技术。

发明内容

本发明旨在提供一种增殖能力强、软骨定向分化潜能强、且在体外及皮下环境中软骨形成稳定的软骨再生种子细胞(残耳软骨干细胞)，以及利用该细胞构建组织工程三维软骨移植物的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化软骨移植物，所述的移植物含有在三维结构下生长的人残耳软骨细胞；所述的人残耳软骨细胞是第1、2、3、4、5、6、7、或8代传代的；较佳地，是第1、2、3、4、或5代的。

在另一优选例中，所述三维结构是由所述的人残耳软骨细胞聚集形成的团块(pellet)、或高密度所述人残耳软骨细胞接种于培养皿所形成的细胞膜片、或是由所述人残耳软骨细胞接种于固体的医学上可接受的生物可降解材料形成；所述高密度是指0.5×10⁶个细胞/cm²-5×10⁶个细胞/cm²；所述医学上可接受的生物可降解材料选自：聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、透明质酸、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、脱细胞基质，及其共聚物或混合物。

在本发明提供的软骨移植物中，所述的人残耳软骨细胞来自自体或同种异体；优选小耳畸形(microtia)患者自体的残耳软骨。

本发明提供的软骨移植物，以所述移植物的总体积计，其中的人残耳软骨细胞浓度为2×10⁷个细胞/cm³-10×10⁷个细胞/cm³；较佳地，为2×10⁷个细胞/cm³-7×10⁷个细胞/cm³。