[发明专利]JAK2基因突变检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是JAK2基因突变检测方法及其试剂盒。

背景技术

JAK2基因位于人9号染色体短臂，具有25个外显子。JAK2的分子结构与功能已经基本了解。James等人(Nature.2005 Apr 28；434(7037)：1144-1148.)将JAK2基因野生型与V617F突变型体外转染细胞株实验发现，野生型能够激活STAT介导的转录过程，而V617F突变型无此功能。他们又进一步将转染有野生型JAK2基因和V617F突变型的细胞移植至小鼠，发现移植了V617F突变性骨髓的小鼠能够引起血细胞异常增多。这些体内和体外实验均表明，JAK2基因V617F突变能够导致MPN的发生。JAK2突变主要发生位点在14号外显子的V617F。(申请号/专利号：200580042022)。但是，在14号外显子上除常见的V617F突变以外，还存在其它如K607N，L611V等多种类型突变(Oncogene.2006Mar 2；25(9)：1434-6.Leukemia.2010 May；24(5)：1069-73.)。JAK2基因12号外显子突变没有突变热点，目前发现JAK2基因12号外显子突变类型及位点至少有十种以上(Blood.February 1，2008 vol.111 no.3 1686-1689)。以往对JAK2的突变检测仅仅针对一种突变类型或者一个突变位点(申请号/专利号：200910051739；申请号/专利号：200780021194；申请号/专利号：200880006541)，因此应用基因测序(Sequence-Based Testing，SBT)技术对JAK2基因12、14号外显子序列进行测序，必将成为检测JAK2基因突变的发展方向。

JAK2突变对骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)的分类和诊断具有划时代的意义。2008年，世界卫生组织(WHO)将骨髓增殖性疾病(myeloproliferativedisorder，MPD)改名为MPN，主要包括以下9种类型，①.慢性粒细胞白血病(CML)②.真性红细胞增多症(PV)③.原发性血小板增多症(ET)④.慢性原发性骨髓纤维化(IMF)⑤.慢性中性粒细胞白血病(CNL)⑥.慢性嗜酸细胞性白血病(CEL)⑦.高嗜酸细胞综合症(HES)⑧.肥大细胞病(MCD)⑨.不能分类的骨髓增殖性肿瘤(MPN-U)。2008年，随着对MPD的肿瘤本质得到确认，WHO将MPD改名为MPN。MPN疾病的单病种发病率大多在1/10万以下，属于罕见疾病。近10年来，随着人们生活水平的提高及医疗条件的改善，已发现的MPN患者总数增加了三倍左右。JAK2基因在PV、ET、IMF中具有较高的突变几率。其中，PV患者JAK2突变率达到90％以上，ET、IMF患者JAK2突变率有50％以上。JAK2突变在其它MPN疾病中也存在一定的突变机率。除在体检中发现外周血异常而跟踪复查并确诊的患者外，本病的漏诊、误诊率很高。因此，JAK2基因是否存在突变对患者的诊断具有重要的意义。

目前，国内只有针对某一位点如V617F突变PCR检测，以及应用探针检测的方法。这些方法在实际应用中存在检测范围小的局限性，而且，从临床角度来讲，还存在一定的漏检率。

发明内容

本发明正是针对以上技术问题，提供一种检测范围广，检测费用低，检测灵敏度高的JAK2基因突变检测方法及其试剂盒，除可对患者外周血检测外，也可对添加肝素的患者骨髓标本进行检测。

本发明通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种JAK2基因突变检测方法，包括以下步骤：

(a)提取待检样本的DNA；

(b)分别用JAK2基因12号外显子PCR扩增引物和JAK2基因14号外显子PCR扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA从正、反两个方向进行PCR扩增；

(c)分别用JAK2基因12号外显子测序反应引物和JAK2基因14号外显子测序反应引物对步骤(b)中扩增后的DNA从正、反两个方向进行测序；

(d)将步骤(c)中的测序结果与标准JAK2基因12号外显子和14号外显子从正、反两个方向进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。

本发明根据人9号染色体基因组序列登录号：NT_008413.18设计JAK2基因12号和14号相关引物如下，

JAK2基因12号外显子PCR扩增引物：