[发明专利]JAK2基因突变检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.本发明提供JAK2基因突变检测方法，包括以下步骤：

(a)提取待检样本的DNA；

(b)分别用JAK2基因12号外显子PCR扩增引物和JAK2基因14号外显子PCR扩增引物对步骤(a)中的待检样本DNA从正、反两个方向进行PCR扩增；

(c)分别用JAK2基因12号外显子测序反应引物和JAK2基因14号外显子测序反应引物对步骤(b)中扩增后的DNA从正、反两个方向进行测序；

(d)将步骤(c)中的测序结果与标准JAK2基因12号外显子和14号外显子从正、反两个方向进行比较，并进行序列分析，即可找出突变类型与突变位点。

2.本发明根据人9号染色体基因组序列登录号：NT_008413.18设计JAK2基因12号和14号相关引物如下，

JAK2基因12号外显子PCR扩增引物：

JAK2E12F：5′-CAATGAGTTGACCCCTAA-3′(NT_008413.18：5059763-5059780)；

JAK2E12R：5′-GCTAACATCTAACACAAGG-3′(NT_008413.18：5060201-5060219)，

JAK2基因12号外显子测序反应引物：

JAK2E12F2：5′-TAGGAGTTATTAAGCATT-3′(NT_008413.18：5059811-5059828)；

JAK2E12R2：5′-AATTCCAATGTCACATGA-3′(NT_008413.18：5060123-5060140)，

JAK2基因14号外显子PCR扩增引物：

JAK2E14F：5′-GCATCTTTATTATGGCAGAG-3′(NT_008413.18：5063611-5063630)；

JAK2E14R：5′-TGGGCATTGTAACCTTCTAC-3′(NT_008413.18：5063981-5064000)，

JAK2基因14号外显子测序反应引物：

JAK2E14F2：5′-TTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGC-3′(NT_008413.18：5063690-5063711)；

JAK2E14R2：5′-GTTTACACTGACACCTAGCTG-3′(NT_008413.18：5063866-5063886)。

3.本发明提供JAK2基因突变检测试剂盒，包括：PCR Amplification Mixture；Primer(12号外显子、14号外显子)、HotStarTaq酶、消化酶、Sequencing Mixture(正向、反向)。

4.根据权利要求3所述JAK2基因突变检测试剂盒，其特征在于JAK2基因突变检测试剂盒采用HotStarTaq DNA Polymerase作为热启动酶，扩增反应体系为：每50μl中含5μl的10倍扩增缓冲液、2μl浓度为25mM的Mg2+、2μl浓度为10mM的dNTPs、1.5μl浓度为10μM的正向引物、1.5μl浓度为10μM的反向引物、0.3μl的Taq DNA聚合酶、1μl的DNA模板、余量为mH₂O，测序反应体系为：4μl的BigdyeV3.1、3μl的mH₂O、1μl浓度为10μM的Sequencing引物(F，R)、2μl的PCR产物。

5.根据权利要求3所述JAK2基因突变检测试剂盒，其特征在于JAK2基因突变检测试剂盒采用的扩增反应步骤为：先95℃反应15min，然后94℃反应0.5min，然后56℃反应0.5min，然后72℃反应1min为一个循环，共反应35个循环然后72℃反应7min，最后4℃保存。

6.根据权利要求3所述JAK2基因突变检测试剂盒，其特征在于JAK2基因突变检测试剂盒采用的测序反应步骤为：先94℃反应0.5min，然后50℃反应0.5min，然后60℃反应2.0min为一个循环，共反应24个循环。