[发明专利]克隆载体

说明书

技术领域

本发明涉及适于PCR产物克隆的载体、使用该载体的克隆方法、该载体的制造方法以及含有该载体的试剂盒。

背景技术

迄今为止，作为目的基因的分离方法已知有利用PCR的方法。在该方法中，首先通过PCR扩增含目的基因的DNA或其片段，将得到的PCR产物组装到克隆用质粒载体中，进一步使用该质粒载体使宿主转化从而形成转化体的单菌落。接下来，由所形成的单菌落精制质粒，对插入到质粒中的DNA片段进行确认。通过这样做，可得到插入有目的基因或其片段的质粒。

在PCR法所用的酶中，已知代表性的Taq DNA聚合酶中存在这样的副反应活性：在复制后的DNA产物的3′末端以非模板依赖性的方式添加1个脱氧腺苷(dA)残基。因此，使用存在这样副反应活性的DNA聚合酶扩增的双链DNA片段的大部分具有添加了1个脱氧腺苷残基的3′端突出结构。

已开发了利用Taq DNA聚合酶并利用开环载体(T载体)的TA克隆法，其中所述开环载体在两个3′末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷(dT)残基(非专利文献1)。通过采用TA克隆法，可在不进行PCR产物的限制性酶处理和末端平滑化处理的情况下得到插入有PCR产物的重组质粒。

然而，传统的TA克隆法存在缺点。在TA克隆中，在含有插入有PCR片段的质粒的转化体鉴别中，通常利用β-半乳糖苷酶基因的α-互补性，即，所谓的蓝白筛选。然而，有时存在以下情况：在相对于衍生自β-半乳糖苷酶的α肽基因的碱基序列通过读码框插入PCR片段时，引起作为融合蛋白的α肽的表达。在这种情况下，导致呈现弱蓝色的假阴性菌落的生成。

另外，在通常的TA克隆法中，不能控制插入到载体中的目的基因的方向性。为了消除该缺点制作了改良型T-载体。例如，在专利文献1中披露了将生成第一限制性酶切位点的引物对与T-载体相组合的方法，其中这样设计所述T-载体：仅在使用所述引物对沿逆向插入PCR扩增产物时出现第二限制性酶切位点。在该方法中，使用切断第二限制性酶切位点的限制性酶仅切断沿逆向插入的质粒，由此可以仅得到这样的转化体：其保持有沿期望方向插入有DNA片段的质粒。然而在该方法中，连接反应之后需要进一步进行限制性酶处理，操作变烦杂。

最近，有人报道了这样的方法：为了控制在TA克隆法中生成假阴性菌落，利用致死基因作为选择标记(非专利文献2)。然而，在该方法中，不能控制插入到载体中的目的基因的方向性。

由以上可知，目前尚不存在这样的克隆载体，其简便地控制PCR扩增产物这样的DNA片段的插入方向，同时可容易地选择仅插入有目的DNA片段的克隆。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2005/021747号小册子

非专利文献

非专利文献1：BioTechniques，1995年，第19卷，第1期，第34-35页

非专利文献2：Molecular Biology Reports，2009年，第36卷，第7期，第1793-1798页

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的是提供克服了上述缺点的TA克隆用载体、使用该载体的克隆方法、该载体的制造方法以及含有该载体的试剂盒。

解决课题的手段

本发明人发现，借助于这样的载体可解决上述课题从而本发明完成，该载体在末端配置了核酸序列缺失的活性丧失耐药性基因，其中所述核酸序列对在耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码。

即，本发明涉及：

[1]一种载体，其为由直链状双链DNA形成的克隆用载体，所述直链状双链DNA在两个3′末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基，该载体的特征在于，其保持有对耐药性基因产物的部分序列进行编码的核酸，所述核酸为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对在所述耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码，此外，所述核酸配置在所述双链DNA中任一者的末端，使得在将其中末端部分含有所述活性丧失耐药性基因中所缺失的核酸序列的插入DNA片段连接到载体时，构成了对没有缺失的耐药性基因产物进行编码的核酸。