[发明专利]克隆载体

权利要求书

1.一种载体，其为由直链状双链DNA形成的克隆用载体，所述直链状双链DNA在两个3′末端具有突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基，该载体的特征在于，其保持有对耐药性基因产物的部分序列进行编码的核酸，所述核酸为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对在所述耐药性基因产物的耐药性发挥中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸进行编码，此外，所述核酸配置在所述双链DNA中任一者的末端，使得在将其中末端部分含有所述活性丧失耐药性基因中所缺失的核酸序列的插入DNA片段连接到载体时，构成了对没有缺失的耐药性基因产物进行编码的核酸。

2.权利要求1所述的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因为缺失了这样的核酸序列的活性丧失耐药性基因，该核酸序列对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码。

3.权利要求2所述的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因由对缺失了C末端氨基酸的β-内酰胺酶的氨基酸序列进行编码的核酸序列形成。

4.权利要求3所述的载体，其中，所述活性丧失耐药性基因由对序列表的序列号17中记载的氨基酸序列进行编码的核酸序列形成。

5.权利要求1所述的载体，还包括第2耐药性基因，所述第2耐药性基因示出与前述耐药性基因不同的对药剂的耐药性。

6.权利要求1所述的载体，其由由序列表的序列号5中记载的核酸序列形成的DNA以及由序列表的序列号18中记载的核酸序列形成的DNA形成。

7.一种克隆DNA的方法，包括以下步骤(a)～(d)：

(a)以DNA为模板，使用第一引物、与第一引物相对的第二引物、以及DNA聚合酶进行PCR的步骤；

(b)将通过步骤(a)得到的PCR产物与权利要求1～6中任一项所述的载体连接，得到环状DNA的步骤；

(c)采用通过步骤(b)得到的环状DNA对宿主细胞进行转化的步骤；以及

(d)利用没有缺失的耐药性基因产物对其示出耐药性的药剂进行药剂选择，由此选择具有环状DNA的转化体的步骤，其中所述环状DNA是通过将PCR产物沿期望方向插入载体而成的；

其中，所述第一引物在3′末端侧具有与前述DNA互补的核酸序列，并且当权利要求1～6中记载的载体中的活性丧失耐药性基因是缺失了对耐药性基因产物的C末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5′末端侧具有所缺失的核酸序列，当权利要求1～6中记载的载体中的活性丧失耐药性基因是缺失了对耐药性基因产物的N末端部分的氨基酸进行编码的核酸序列的基因时，所述第一引物在5′末端侧具有从所缺失的核酸序列的互补链序列脱除了5′末端的脱氧胸腺嘧啶核苷后的核酸序列。

8.权利要求7所述的克隆方法，其中步骤(a)中的DNA聚合酶具有在反应产物的3′末端以非模板依赖性的方式添加1个脱氧腺苷碱基的活性。

9.权利要求7所述的克隆方法，其中，在步骤(a)中还包括在反应产物的3′末端添加1个脱氧腺苷碱基的步骤。

10.一种载体的制造方法，包括下列步骤：通过限制性酶PmaCI切断具有序列表的序列号19中记载的核酸序列的环状双链DNA的步骤；以及通过具有末端脱氧核苷酸转移酶活性的酶，在切断后的双链DNA的两个3′末端添加突出的1个脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷残基从而得到权利要求1中所述的载体的步骤。

11.一种试剂盒，其为克隆用试剂盒，含有权利要求1～6中任意一项所述的载体以及DNA连接酶。