[发明专利]添加剂预混料样品中酿酒酵母的快速定性、定量测定方法

说明书

技术领域

本发明属于饲料科学与饲料添加剂检测技术领域，具体涉及一种添加剂预混料样品中酿酒酵母的快速定性、定量测定方法。

背景技术

微生态饲料添加剂因其丰富的营养价值和特殊的益生功效以及绿色环保特性而成为预混料领域人们关注的热点。目前市场上的微生态饲料添加剂种类繁多，并且每年以高速度增长。尽管微生态饲料添加剂在畜牧养殖业上的应用日益广泛，但尚未形成统一的质量标准和完善的管理机制，对其质量的监管和认证，尤其在定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法，究其原因是基础研究薄弱，现有检测技术或检测周期长、或不能区分死菌活菌、或成本高，难以建立标准化检测技术。传统方法中对酿酒酵母菌的定性、定量检测，仍采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离技术的方法。传统方法易受外界环境因素和培养性能的影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时耗力。现阶段急需从生产实际出发，逐步建立起科学有效的、易于推广的饲用菌种快速高效标准化检测技术，促进微生态饲料添加剂行业的可持续发展。

PCR技术一经出现就被广泛应用于分子生物学和微生物学等领域。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的出现更是实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题。具有特异性强、重复性好、准确、快速等优点，成为了分子生物学和微生物领域定量检测的重要方法。

发明内容

【要解决的技术问题】

本发明的目的在于提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性测定方法。

本发明的另一个目的是提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定量测定方法。

本发明采用酿酒种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立简便、快速、准确的添加剂预混料中酿酒酵母快速分子检测方法，可简化酿酒酵母的检测程序、提高检测效率。

【技术方案】

本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明提供一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性测定方法，该方法使用酿酒酵母的DNA为模板，以酿酒酵母的26s rDNA基因序列的种属特异性引物进行种属特异性PCR反应，扩增片度长度为134bp，进而快速定性酿酒酵母；所述的种属特异性引物如下：上游引物DZf5’-CGAGAGACCGATAGCGAACA-3’，下游引物DZr5’-AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3’。

进一步，该方法的步骤如下：

A.模板DNA的制备

采用玻璃珠法制备饲料样品模板DNA：

(1)取1g含有酿酒酵母菌的预混料样品于1.5mL离心管中，加入500μLPBS悬浮样品，2500×g离心3min；

(2)弃上清，加入适量酸洗过的玻璃珠，剧烈震荡2min；

(3)加入400μL TE及等体积的Tris饱和酚，翻转混匀，15000×g离心5min；

(4)转移水相至一新离心管，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1的混合物，颠倒混匀，15000×g离心5min；

(5)吸上清至一新离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc及2.5倍体积95％冰乙醇，-20℃过夜；

(6)4℃15000×g离心10min，弃上清；

(7)加入1mL70％乙醇，15000×g离心5min，弃上清；

(8)37℃放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60μL TE中，-20℃保存备用；

B.PCR扩增

反应体系25.0μL：12.5μL 2×PCR-mix、各1μL 10mmol/L上、下游引物、1μL 50ng/μL DNA模板、二次蒸馏水补足至25.0μL；

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃30s，60℃45s，72℃40s，进行35个循环，72℃最终延伸7min，得到的PCR产物，在温度4℃下保存；

取5μLPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳进行检测；

C.结果及判断

检测时设以目的扩增片度的胶回收产物作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模板为阴性对照；根据在134bp处出现预期特征条带，确定该预混料样品中含有酿酒酵母，相反地则不合有酿酒酵母。