[发明专利]添加剂预混料样品中酿酒酵母的快速定性、定量测定方法

权利要求书

1.一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定性测定方法，其特征在于使用酿酒酵母的DNA为模板，以酿酒酵母的26s rDNA基因序列的种属特异性引物进行种属特异性PCR反应，扩增片度长度为134bp，进而快速定性酿酒酵母；所述的种属特异性引物如下：上游引物DZf5’-CGAGAGACCGATAGCGAACA-3’，下游引物DZ r 5’-AAGGAGCAGAGGGCACAAA-3’。

2.如权1所述的快速定性测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A.模板DNA的制备

采用玻璃珠法制备饲料样品模板DNA：

(1)取1g含有酿酒酵母菌的预混料样品于1.5mL离心管中，加入500μL磷酸盐缓冲液悬浮样品，2500×g离心3min；

(2)弃上清，加入适量酸洗过的玻璃珠，剧烈震荡2min；

(3)加入400μL TE缓冲液及等体积的Tris饱和酚，翻转混匀，15000×g离心5min；

(4)转移水相至一新离心管，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1的混合物，颠倒混匀，15000×g离心5min；

(5)吸上清至一新离心管，加入1/10体积3mol/L醋酸钠及2.5倍体积95％冰乙醇，-20℃过夜；

(6)4℃15000×g离心10min，弃上清；

(7)加入1mL70％乙醇，15000×g离心5min，弃上清；

(8)37℃放置15min干燥沉淀，沉淀溶于60μL TE缓冲液中，-20℃保存备用；

B.PCR扩增

反应体系25.0μL：12.5μL 2×PCR-mix、各1μL 10mmol/L上、下游引物、1μL 50ng/μL DNA模板、二次蒸馏水补足至25.0μL；

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃30s，60℃45s，72℃40s，进行35个循环，72℃最终延伸7min，得到的PCR产物，在温度4℃下保存；

取5μLPCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳进行检测；

C.结果及判断

检测时设以目的扩增片度的胶回收产物作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模板为阴性对照；根据在134bp处出现预期特征条带，确定该预混料样品中含有酿酒酵母，相反地则不含有酿酒酵母。

3.一种添加剂预混料样品中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的快速定量测定方法，其特征在于以待测样品cDNA和标准品的cDNA为模板，使用权利要求1中所述的上游引物和下游引物，以相同的体系同时进行酿酒酵母26s rDNAD1/D2的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行预混料样品中酿酒酵母的快速定量检测。

4.如权3所述的快速定量测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A.样品总RNA的制备

采用酶法破除酿酒酵母细胞壁，高纯总RNA，快速提取试剂盒提取样品总RNA：样品0.5-1.0g加入到1.5mL离心管中，加入600μL山梨醇Buffer，加入50U溶壁酶，充分混匀30℃处理30min，1500×g离心10min后，弃上清，收集沉淀，提取样品RNA，然后用DNase I处理两次，得到纯化的RNA样品，使用紫外分光光度仪测定浓度，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后将样本保存于-80℃；

B.反转录扩增

(1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：

1-5μg总RNA、2μL Oligo(dT)15、2μLdNTP、补RNase-free ddH₂O定容至14.5μL；

(2)70℃加热5min后迅速在冰上冷却2min，快速离心反应液后加入以下组分：4μL 5×First-Strand Buffer(含有DTT)；0.5μL RNasin；

(3)加入1μLTIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀；

(4)42℃温浴50min；

(5)95℃加热5min，终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存；

(6)用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μL。-20℃保存备用；

C.荧光定量PCR

反应体系25.0μL：12.5μL 2×SuperReal PreMix、各0.75μL 10μmol/L上下游引物DZf和DZr，2.0μL cDNA模板、0.5μL 50×ROX Reference Dye、补RNase-free ddH2O至25μL体系；

荧光定量PCR反应参数：95℃预变性15min；95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环；4℃保存；每个样品重复3次；

D.外标准品的制备和标准曲线的绘制

外标准品的制备：利用分光光度计将过夜培养的酿酒酵母菌发酵液稀释至1OD，按照上述提取总RNA步骤并通过反转录扩增获得cDNA，进行10倍系列稀释，梯度稀释至10⁷-1个酵母cDNA/μL的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；

标准曲线的绘制：以不同浓度的模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数为纵坐标得到的酿酒酵母菌的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准；

E.结果及判断

以待测样品cDNA和标准品的cDNA为模板，用酿酒酵母菌的种特异性引物，以相同的体系同时进行酿酒酵母菌26s rDNA D1/D2的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行饲料样品中酿酒酵母菌的快速定量检测。