[发明专利]转葡糖苷酶及其制备和固定化方法

权利要求书

1.一种黑曲霉菌株（Aspergillus niger）BLB-28，其特征在于以从土壤中筛选的黑曲霉（Aspergillus niger）BLB-16为出发菌株 ，经紫外线+LiCl复合诱变，并经筛选获得；该菌株已于2011年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No 5143。

2.一种转葡糖苷酶，其特征在于应用黑曲霉菌株（Aspergillus niger）BLB-28，发酵制得。

3.如权利要求2所述转葡糖苷酶的制备方法，其特征在于以黑曲霉（Aspergillus niger）BLB-28为发酵菌株，经种子培养、发酵、超滤除菌、纳滤浓缩，制备转葡糖苷酶液。

4.如权利要求3所述转葡糖苷酶的制备方法，其特征在于所说的种子培养的培养基组成为：葡萄糖300-500g/L、酵母膏16 g/L、琼脂粉18g/L、磷酸二氢钾1.2 g/L、硫酸镁0.45g/L、尿素1g/L，pH5.5-6.0。

5.如权利要求3所述转葡糖苷酶的制备方法，其特征在于所说的发酵的培养基组成为：葡萄糖300-500g/L、酵母膏18 g/L、琼脂粉15g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5g/L、尿素2g/L，pH5.5-6.0。

6.如权利要求3所述转葡糖苷酶的制备方法，其特征在于所说的超滤除菌采用陶瓷复合膜过滤除菌及纯化。

7.如权利要求3所述转葡糖苷酶的制备方法，其特征在于所说的纳滤浓缩采用有机复合纳滤膜浓缩及纯化。

8.如权利要求2所述转葡糖苷酶的固定化方法，其特征在于将转葡糖苷酶液经树脂吸附-海藻酸钠包埋-戊二醛交联法固定化，制备固定化转葡糖苷酶。

9.如权利要求3或8所述转葡糖苷酶的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：

1）步骤1--菌种的诱变筛选；

由从土壤中筛选的黑曲霉（Aspergillus niger）BLB-16 ，经紫外线+LiCl复合诱变，并经筛选获得黑曲霉菌株（Aspergillus niger）BLB-28；

2）步骤2--菌种活化；

将低温保藏的黑曲霉菌株（Aspergillus niger）BLB-28，经一级种子培养进行活化，二级种子培养进行扩大培养；培养条件为：pH5.5-6.0，培养温度为25-40℃，培养时间18-24h；

3）步骤3--发酵；

将经过扩大培养的种子接种于发酵培养基，进行发酵培养；其中，接种量为5-12%（V/V），发酵条件为：pH5.5-6.0，培养温度为25-40℃，溶氧为28-30%，发酵时间96-120h； 

4）步骤4--超滤除菌；

采用陶瓷膜超滤，除去发酵菌体，制备转葡糖苷酶液；

操作条件：0.5-1.0MPa，4-25℃；陶瓷膜截留分子量为150-200 kDa；

5）步骤5--纳滤浓缩；

采用有机复合纳滤膜进行浓缩，操作条件为：压力0.5-2.0MPa，温度4-25℃，制备转葡糖苷酶液；有机复合纳滤膜截留分子量200-2000Da；

6）步骤6--酶的固定化；

树脂吸附-海藻酸钠包埋-戊二醛交联法固定化，制备固定化酶；固定化条件为：室温下，在转葡糖苷酶液中加入一定量的D301（R）型树脂，振荡吸附8-12h后滤出；再用3%海藻酸钠包埋，浸泡于0.1mol/L CaCl₂溶液中硬化4h，滤出，最后将其浸泡于1.5-2%的戊二醛溶液1.5h，滤出，即得到固定化酶；

7）步骤7—固定化酶活性及稳定性检测；

 将固定化酶装柱，配制pH5.0-6.0的麦芽糖液，按一定的流速过柱，流速0.6-1.8倍柱体积/h，不间断进行实验，定期取样检测低聚异麦芽糖产品组分；

葡糖苷酶应用于食品、药品、饲料工业领域，用于低聚异麦芽糖的生产。