[发明专利]一种公牛冻精基因组DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因组DNA的提取方法，具体地说，涉及一种公牛冻精基因组DNA的提取方法。

背景技术

荷斯坦奶牛是为人类提供乳品的重要家畜品种，随着人们对奶制品质量要求的更新和提高，为满足市场需求，需要对奶牛选育及提高奶牛群体产奶性能。遗传育种与人工授精技术的实现，使优良公牛的精液被用于制作大量冻精(细管冻精或颗粒冻精)，便于其优良遗传性能的传播，提高群体性能。随着分子生物学和遗传学的发展，从分子生物学角度进行荷斯坦奶牛的选育和提高性能，是当前研究的热点。相对于血样和耳组织样品等，冻精数量多，容易获得和保存，是种用公牛最常见的实验材料。DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了对其进行测序、杂交和基因的表达的研究，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的。基因组DNA提取的主要包含两方面操作：一是细胞裂解和DNA释放，二是DNA的纯化。这两方面决定着基因组提取产物的产率、完整性和纯化度。目前市场上存在着动物不同组织基因组提取试剂盒，最常见的是血液基因组DNA提取的相关产品，采用创新的裂解液成分和纯化方式，给血液样品基因组的提取带来了便利。而相对于冻精，却鲜见商品化的试剂盒。其基因组提取最常见的方法是利用加入β-巯基乙醇的蛋白消化液消化精子，释放DNA后利用酚/氯仿的有机溶剂抽提法纯化产物(萨姆布鲁克J，拉塞尔D.W.分子克隆指南[M]北京，科学出版社，2002)。这种方法在实际应用中存在以下问题：提取时间长，操作繁琐，产物中残留的有机溶剂影响后续实验，冻精消化难度大，给实验室批量提取高质高量的冻精基因组DNA带来困难。

哺乳动物精子DNA是遗传信息的载体，对繁衍后代具有重要意义，这一特殊使命要求精子的染色质具有特殊结构。与其他细胞不同，精子的染色质形成经过了加倍浓缩与组装(蒋欢欢综述，曹云霞，贺小进审校.精子染色质完整性检测与辅助生殖技术.国际生殖健康/计划生育杂志，2011，1，30(1)：58-62；邹喻苹，汪小全，雷一丁，裴颜龙，张志宪.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定3，植物学报，1994，36(7)：528-533)。哺乳动物精子的发生可分为精原细胞、精母细胞、精子细胞三个阶段。在精子细胞阶段，核内与DNA结合的组蛋白(H1、H2a、H2b、H3、H4)逐步被精蛋白取代，这个过程称为组蛋白-精蛋白取代反应(histone-to-protamine replacement reaction，HPRR)，(吴小芳，陈晖，陈松，曹坚，费仁仁.人与大小鼠精子中精蛋白mRNA的分析，生殖与避孕，2001，08，21(4)：200-206)。精蛋白是一种低分子量碱性蛋白(分子量为4000-7000)含有27-65个氨基酸残基，富含精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)(赵向东综述，黄宇烽审校，精核蛋白的研究进展，Journal of Andrology，1998，11，4：38-41)。精子DNA围绕精蛋白形成染色质基本结构，而后精蛋白分子内外巯基进一步氧化形成的二硫键广泛交联，从而使染色体逐渐浓缩，更加稳定。成熟精子核这一致密化现象对保护精子基因组在精子面临外界应激时保持完整性具有重要作用，能够保证遗传物质完整的传递到后代中(蒋欢欢综述，曹云霞，贺小进审校，精子染色质完整性检测与辅助生殖技术，国际生殖健康/计划生育杂志，2011，1，30(1)：58-62)。正是因为成熟精子细胞的这种致密特性造成精子相对于其它组织细胞的染色体更加致密，基因组DNA不容易与精蛋白脱离。使得精子DNA在消化中释放困难，产率低。另外，冻精中出于对精细胞稀释、营养和保护需要而添加的稀释保护剂，其所含有的糖类、脂类和蛋白等成分也给细胞的消化和基因组的纯化带来障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种公牛冻精基因组DNA的提取方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种公牛冻精基因组DNA的提取方法，包括精子细胞的清洗、精子的裂解消化以及DNA的纯化步骤，其中，