[发明专利]一种针对ppGalNAc-T13多克隆抗体的特异性抗原肽及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学及分子免疫学领域，主要涉及了一种针对ppGalNAc-T13多克隆抗体的特异性抗原，并公开了所述抗原肽的制备及其在ppGalNAc-T13多克隆抗体制备中的应用。

背景技术

多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族(ppGalNAc-Ts)是O-型糖蛋白糖链合成反应的第一步起始糖基转移酶，其催化形成Tn抗原(GalNAc-Ser/Thr)。ppGalNAc-T是一个大的基因家族，现在已报道的ppGlaNAc-T有20种。ppGalNAc-Ts家族成员均为II型膜蛋白，N端有一个4～22个氨基酸的胞浆区，继以一个15～25个氨基酸的穿膜区，通过一个长短不一的茎区与C端伸入高尔基体内大约450个氨基酸的催化区相连接。ppGalNAc-Ts基因家族各个成员的在不同组织中的表达有很大差异，例如ppGalNAc-T1是各组织广泛分布的，ppGalNAc-T14为肾脏组织特异性表达，ppGalNAc-T13为神经细胞特异性表达等。目前国际上关于ppGalNAc-Ts基因家族的功能研究方兴未艾，近年取得一些初步进展，例如，ppGalNAc-T1参与淋巴细胞和血细胞表面selectin ligand糖基化，ppGalNAc-T1的缺失影响微血管循环和淋巴细胞归巢，还会造成B细胞的凋亡；ppGalNAc-T3参与FGF23的糖基化修饰，保护其不受furin蛋白酶的剪切，使得FGF23能够正常分泌到胞外行使功能。已在瘤样钙质沉积的病人中发现多例ppGalNAc-T3基因上SNP，直接与瘤样钙质沉积病的形成相关；ppGalNAc-T14参与死亡受体DR4和DR5的糖基化修饰，增强细胞对Apo2L/TRAIL的敏感度，对于肿瘤的药物治疗有着重大意义；在Xenopus中的研究发现T16参与调控TGF-beta，Activin，BMP信号通路，对于Xenopus的中枢神经系统发育起到了十分重要的作用。ppGalNAc-Ts家族成员因其不同的组织分布以及其和肿瘤、发育的相关性，使得ppGalNAc-Ts家族各成员可以用做肿瘤诊断和发育的标志物，在科研和临床上有重大的应用价值。例如，ppGalNAc-T3可作为前列腺癌的标志物，并且与肺腺癌病人的生存期有一定的相关性；ppGalNAc-T6可以作为乳腺癌的免疫组化检测标志；ppGalNAc-T12可作为结肠癌发生、发展的负指数；ppGalNAc-T13可作为神经母细胞瘤向骨髓转移的标志物。

ppGalNAc-T家族具有极高的保守性，家族成员间蛋白质序列的同源性都在40％以上，尤其是本发明中涉及的ppGalNAc-T13与同家族中的ppGalNAc-T1在蛋白质序列上的相似度高达85％，因此，如何保证T13抗体的特异性至关重要。

目前，已报导的ppGalNAc-Ts家族中多克隆抗体的制备方法主要有两种：一种是使用合成多肽作为抗原；一种是使用外源表达的完整的ppGalNAc-Ts全酶作为抗原。这两种方法各有优劣。使用合成多肽作为抗原的优点在于可以选择同源性较低的多肽片段作为抗原，以保证抗体的特异性；但是，合成的多肽一般只有十几个氨基酸残基，分子量较小，免疫原性较差，通常需要将其与MAP(multiple antigenic peptide)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等蛋白载体偶联，有些还需加入免疫佐剂，因此，此方法成本十分高昂：通常合成10～20mg的纯度85％以上的抗原蛋白价格一般在120元/氨基酸残基，偶联MAP的价格在一千元以上。使用外源表达的完整ppGalNAc-Ts全酶作可以为抗原可以大大提高其免疫原性，但是对于生产出来的抗体特异性比较难保证，尤其像ppGalNAc-T13与ppGalNAc-T1两种糖基转移酶的氨基酸序列相似度高达85％，如使用全酶做抗原，基本不可能产生特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体。

发明内容

为克服现有多克隆抗体制备方法价格昂贵、免疫原性差(合成多肽法)以及特异性不能保证(全酶法)等不足，本发明提供了一种ppGalNAc-T13的特异性抗原及其多克隆抗体的制备方法。本发明制备的ppGalNAc-T13抗体不与相似度高达85％的ppGalNAc-T1发生交叉反应，也不与ppGalNAc-Ts家族中的其他成员发生交叉反应；本发明通过原核表达系统获得抗原，并且抗原携带有GST(glutathione S-transferase)标签，易于纯化；本发明克服了合成多肽免疫原性差、价格昂贵的缺点，同时也具备极高的特异性。

本发明所采用的技术方案：