[发明专利]戊型肝炎病毒的病毒样颗粒的组装机制及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和病毒学领域。特别地，本发明阐明了戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)的组装机制，并提供了一种用于将HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的方法。此外，本发明还提供了用于控制HEVVLP的组装的方法，其通过控制盐浓度和/或温度来控制HEV衣壳蛋白或其变体或片段至VLP的组装。

背景技术

戊型病毒性肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)感染导致的，其是主要的病毒性肝炎之一，并且多数呈自限性。戊型病毒性肝炎的症状与甲型肝炎类似，但病死率更高，症状更重：孕妇病死率可高达20％，并且慢性肝病患者合并HEV感染易引发肝衰竭，死亡率达70％。

HEV主要通过肠道传播，但亦可通过输血或垂直途径传播，常常导致大规模的爆发流行。近半个世纪以来，文献记载了万例以上的戊型肝炎大爆发近十起，其中规模最大的一次发生于1986-1988年的中国新疆，共发病119,280例，死亡707人，其中包括414名孕妇。由于人们对HEV的研究很有限，因此长期以来戊型肝炎处于一种被忽视的状态。进入21世纪以来，随着戊型肝炎诊断试剂的灵敏度和特异性的大幅度提高，越来越多的戊型肝炎病例被确诊。据统计，全球大约有三分之一的人口曾感染过HEV。

越来越多的证据显示，戊型肝炎是一种人兽共患疾病。猪是HEV的最主要动物宿主，并且是人类戊型肝炎的重要传染源。我国学者对全国20个省市120个养猪场以及进口检疫的9,055只猪的HEV感染情况进行了血清学调查，结果证实我国商品猪中的HEV感染极其常见，总感染率高达83％，并且从国内多个地区的猪中分离到了HEV病毒株。

戊型肝炎病毒(HEV)是一种单股正链的RNA病毒，其衣壳是由单一结构蛋白组装成的T＝3的二十面体对称结构，包裹约7.2kb的基因组。HEV病毒颗粒的直径为约27～34nm，无包膜。HEV基因组包含5′端帽状结构和多聚A尾，并且包含三个相互重叠的开放性读码框(ORF：ORF1，ORF2和ORF3)，其两侧分别为一个短的5′端非编码区(5′UTR)和一个由多聚腺苷酸终止的短的3′端非编码区(3′UTR)。ORF1长约5kb，位于编码区的5′末端，是HEV最大的开放读码框，其主要作用为：在RNA合成酶的参与下，编码与病毒RNA复制有关的非结构蛋白(pORF1)。ORF2长约2kb，位于编码区的3′末端，为HEV的主要结构基因编码区，其主要作用为：编码病毒衣壳蛋白pORF2——一种含660个氨基酸的糖基化蛋白。近来还针对ORF2蛋白与HEV基因组5′末端的特异RNA结合活性进行了研究，结果显示，两者的相互作用可能有助于病毒衣壳的形成。ORF 3是一个小的开放读码框，功能尚未被阐明。目前有研究提示，HEV ORF3蛋白可能在细胞信号转导、HEV颗粒组装、释放及免疫等方面起着重要的作用。

根据ORF2结构蛋白基因的同源性，HEV至少可分为4个主要的基因型。分子流行病学研究表明，HEV基因1型和2型主要感染人类，常导致爆发流行；基因3型和4型可同时感染动物和人类，呈散发性流行。四种型别的HEV代表株分别为缅甸株、墨西哥株、美国株和中国变异株。目前，将鸡HEV归为基因5型。各型HEV在ORF2氨基酸序列上具有较高的同源性，这导致在HEV血清学上世界各地的HEV均为同一血清型。各基因型病毒间的可交叉保护，大大简化了疫苗研制的难度。

目前，HEV的细胞培养和组织培养均未能获得成功。然而，由于HEV的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)具有良好的免疫反应性和免疫原性，可用于研制重组戊型肝炎疫苗。因此，国内外戊型肝炎疫苗的研制主要如下：通过各种表达系统获得结构蛋白，然后在体内或体外将结构蛋白组装成为病毒样颗粒(VLP)，从而制备获得VLP疫苗。目前，关于HEV VLP用于疫苗研究的报道包括如下：(1)通过利用杆状病毒/昆虫细胞表达HEV ORF2片段aa112-aa 07，可在细胞裂解物中获得体内自组装的HEV VLP(Robinson等，Protein Expr Purif.1998，12(1)：75-84)；(2)利用大肠杆菌表达HEV ORF2片段aa368-aa606，其可在体外自组装成为HEV VLP(Li等，Vaccine.2005，23：2893-2901；Li等，JBC.2005，28(5)：3400-3406)。