[发明专利]一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纺锤体检验点抑制物，尤其是涉及一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法。

背景技术

在真核生物中，纺锤体检验点(The spindle checkpoint)是保证细胞分裂过程中染色体正确分离的重要监控机制之一。细胞纺锤体检验点功能被削弱是肿瘤细胞的一个重要特征。然而现有研究表明，完全抑制细胞的纺锤体检验点却可以诱导细胞死亡。由于正常细胞与肿瘤细胞在纺锤体检验点功能上的差异使得纺锤体检验点成为目前抗肿瘤药物研发的靶点之一。国外有实验室([1]DeMoe JH，Santaguida S，Daum JR，Musacchio A，Gorbsky GJ：A high throughput，whole cell screen for small molecule inhibitors of the mitotic spindle checkpoint identifies OM137，a novel Aurora kinase inhibitor.Cancer Res 2009；69：1509-1516；[2]Stolz A，Vogel C，Schneider V，Ertych N，Kienitz A，Yu H，et al：Pharmacologic abrogation of the mitotic spindle checkpoint by an indolocarbazole discovered by cellular screening efficiently kills cancer cells.Cancer Res 2009；69：3874-3883)建立了高通量的纺锤体检验点抑制物的筛选方法并正在进行相关化合物的筛选，但这些筛选方法存在着操作步骤繁琐、成本高及需要借助特殊仪器设备等缺点，限制了这些筛选方法的广泛应用，国内目前还未见有关建立纺锤体检验点抑制物筛选方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可供高通量的筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法。

本发明包括以下步骤：

1)将Hela细胞置于细胞培养皿上在培养液中培养；

在步骤1)中，所述培养液可采用DMEM细胞培养液，所述培养可在37℃，5％CO₂的条件下培养。

2)当细胞密度达到80％～90％时，加入诺考达唑(Nocodazole)处理，收集从培养板上脱落的有丝分裂细胞并将其转移到96孔板或384孔板上；

在步骤2)中，所述处理的时间可为12～16h，所述加入诺考达唑的终浓度可为50～200ng/ml；所述96孔板或384孔板上的细胞密度为10,000～20,000个/孔。

3)随后加入待测化合物，阴性对照组加入细胞培养液，培养；

在步骤3)中，所述加入待测化合物的量，按体积比，培养液∶待测化合物为1000∶1；可根据化合物文库及实验目的自己设计化合物终浓度(根据具体药物种类选择具体浓度)，所述细胞培养液可为等量的DMEM细胞培养液，所述培养可在37℃下细胞培养箱中培养4～6h。

4)洗去未贴壁细胞，加入细胞培养液反应；

在步骤4)中，所述洗去未贴壁细胞可用PBS洗去未贴壁细胞，最好重复2～3次；所述细胞培养液可采用含0.5mg/ml MTT((3-(4，5-cimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium Bromide；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝)的细胞培养液；所述细胞培养液的加入量可为待测化合物的10～20倍，所述反应的温度可为37℃，反应的时间可为2～4h。

5)去掉细胞培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)，溶解步骤4)中形成的甲瓒结晶，再检测OD570读值；

在步骤5)中，所述加入二甲基亚砜的量可为每孔加入100μl；所述检测可采用酶标仪检测。

6)当待测化合物所对应孔的OD570与阴性对照孔的OD570之间比值大于2时，该待测化合物可被认为是潜在的纺锤体检验点抑制物；

7)进行第二轮筛选，以排除潜在的纺锤体检验点抑制物中的假阳性，其具体方法是重复上述步骤1)和2)，并在原步骤2)中多加入终浓度为10～20uM的MG132；

8)加入从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物，阴性对照孔加入等量的DMEM细胞培养液培养；