[发明专利]一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法

权利要求书

1.一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将Hela细胞置于细胞培养皿上在培养液中培养；

2)当细胞密度达到80％～90％时，加入诺考达唑处理，收集从培养板上脱落的有丝分裂细胞并将其转移到96孔板或384孔板上；

3)随后加入待测化合物，阴性对照组加入细胞培养液，培养；

4)洗去未贴壁细胞，加入细胞培养液反应；

5)去掉细胞培养液，加入二甲基亚砜，溶解步骤4)中形成的甲瓒结晶，再检测OD570读值；

6)当待测化合物所对应孔的OD570与阴性对照孔的OD570之间比值大于2时，该待测化合物可被认为是潜在的纺锤体检验点抑制物；

7)进行第二轮筛选，以排除潜在的纺锤体检验点抑制物中的假阳性，其具体方法是重复上述步骤1)和2)，并在原步骤2)中多加入终浓度为10～20uM的MG132；

8)加入从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物，阴性对照孔加入等量的DMEM细胞培养液培养；

9)重复上述步骤4)和5)；

10)潜在的纺锤体检验点抑制物所对应孔的OD570与阴性对照孔的OD570之间比值在0.6～1.2之间，该化合物可被认为是纺锤体检验点抑制物，可被用于做进一步的分析。

2.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养液采用DMEM细胞培养液，所述培养是在37℃，5％CO₂的条件下培养。

3.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤2)中，所述处理的时间为12～16h。

4.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤2)中，所述加入诺考达唑的终浓度为50～200ng/ml。

5.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤3)中，所述加入待测化合物的量，按体积比，培养液∶待测化合物为1000∶1。

6.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤3)中，所述细胞培养液为等量的DMEM细胞培养液，所述培养是在37℃下细胞培养箱中培养4～6h。

7.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤4)中，所述洗去未贴壁细胞是用PBS洗去未贴壁细胞，最好重复2～3次。

8.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤4)中，所述细胞培养液采用含0.5mg/ml 3-(4，5-cimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium Bromide；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐的细胞培养液；所述细胞培养液的加入量为待测化合物的10～20倍，所述反应的温度为37℃，反应的时间为2～4h。

9.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤5)中，所述加入二甲基亚砜的量为每孔加入100μl。

10.如权利要求1所述的一种筛选细胞纺锤体检验点抑制剂的方法，其特征在于在步骤8)中，所述加入从步骤6)中筛选出来的潜在纺锤体检验点抑制物的量与步骤3)所加入的待测化合物的量相同；所述培养，是在37℃下细胞培养箱中培养4～6h。