[发明专利]检测致病曲霉菌的荧光定量PCR通用引物、检测探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地是涉及一种检测致病曲霉菌的荧光定量PCR通用引物、检测探针和试剂盒。

背景技术

近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用以及血液恶性肿瘤、器官移植等免疫低下人群的不断增多，深部真菌感染的发病率正在急剧上升。其中，曲霉菌在免疫力低下患者中已成为仅次于白色念珠菌的重要致病真菌。在免疫缺陷患者中，曲霉菌感染的发病率高达50％。曲霉菌感染，特别是侵袭性曲霉病预后很差，尽管新的抗真菌药不断出现并用于临床治疗，但是病死率仍高达50％～90％。由于该病临床表现无特异性，致使诊断较为困难，约30％的病例在尸检时才能确诊。早期诊断曲霉菌感染是提高患者生存率和改善患者预后的关键，发展早期快速诊断曲霉菌感染的新方法已刻不容缓。

目前，临床上常用的诊断方法包括：真菌显微镜检查和培养、组织病理学检查、影像学检查以及血清学检查。但是，这些方法都存在一定的缺陷和局限性：传统的培养及镜检方法阳性率低、耗时长；组织病理学检查为侵入性操作，不易取材，且需要免疫组化方法来进一步鉴定菌种；影像学检查所见的Halo征是侵袭性肺曲霉菌病早期的特征性表现，但缺乏特异性；血清学检查特异性抗原或代谢产物的方法如检测半乳甘露聚糖抗原(GM抗原)和(1→3)2β2D2葡聚糖(G实验)虽然快速简便，但其敏感性、特异性以及在早期诊断、病情监测方面的价值仍然不能令人满意，且无法鉴定曲霉菌的菌种。

目前最有发展前景的是分子生物学方法----多聚酶链反应(PCR)技术。

传统的PCR技术：最常用于曲霉菌诊断的传统PCR技术是巢式PCR(nested-PCR)，是通过“外”、“内”两对引物完成的两轮PCR反应，即一对扩增较大DNA片段的外引物和一对以扩增产物为模板再扩增小片段的内引物。巢式PCR虽较灵敏，但需进行两次PCR，增加了污染机会，提高了其假阳性率。

实时定量PCR技术：传统PCR技术的另一缺陷是PCR产物不易定量，自1995年美国PE公司提出实时PCR检测原理后，实时定量PCR(real-time PCR)以其快速、灵敏、特异、定量、无交叉污染等突出优点在医学领域得到广泛应用，在曲霉菌感染的诊断中已展现出诱人的前景。主要包括以下几种：

1.非特异性荧光染料染色法(SYBR Green I染料)：荧光染料能特异性地结合双链DNA，而不结合单链DNA。此种方法的优点是简便易行，缺点主要是特异性不强，染料可以和任何双链DNA结合，不能区分引物二聚体、非特异性扩增产物与特异性扩增产物。为了减少非特异扩增产物和引物二聚体的干扰，可以在PCR完成后立即进行融解曲线分析。

2.特异性探针杂交方法：因为荧光染料法特异性不高，而且不适合进行多重PCR分析，为了克服这些缺陷，人们发展了特异性荧光探针杂交技术，包括Taqman探针、分子信标、Scorpion引物，杂交探针方法等方法。

过去，国内外大部分关于曲霉菌DNA检测的研究都主要集中于被认为是主要感染菌的烟曲霉菌，或仅为曲霉菌属，而不鉴定到种。但最近有报道指其它种类的曲霉菌种感染也在不断增多，例如包括黄曲霉，黑曲霉和土曲霉，95％以上的侵袭性曲霉病由以上四种曲霉菌感染造成。此外，有研究指，土曲霉对传统的抗真菌药两性霉素B显示出逐渐升高的耐药趋势，因此，种的进一步区分显得尤为重要。

本发明拟借助TaqMan荧光定量PCR技术，通过构造特异性的多重荧光探针和通用引物，建立一种能同时检测鉴定烟曲霉，黄曲霉，黑曲霉，和土曲霉四种曲霉菌的多重荧光定量PCR诊断技术，更好的扩展和完善了除烟曲霉菌外的检测能力，并且具有同样高的敏感性和特异性，以利于侵袭性曲霉菌病的早期诊断和针对性治疗。

发明内容

为了克服现存各种曲霉菌检测技术的缺陷性和局限性，本发明的目的之一是一种可用于曲霉菌的荧光定量PCR检测的通用引物。

实现该目的的技术方案如下：

一种用于曲霉菌的荧光定量PCR检测的通用引物，其碱基组成如SEQID.NO：1和SEQ ID.NO：2所示。

本发明的另一目的是提供一种用于曲霉菌的荧光定量PCR的检测探针，该探针是分别针对四种主要致病性曲霉菌包括烟曲霉，黄曲霉，黑曲霉，土曲霉特异性基因序列的。

实现该目的的技术方案如下：