[发明专利]一种利用小型猪红细胞系统评价眼刺激性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用小型猪红细胞系统评价眼刺激性的方法。

背景技术

眼睛时常接触多种物质，包括化妆品、药品、农药和环境污染物等，这些外源物质的主观接触或意外暴露可能造成人群的健康风险。因此，评估和调查化妆品/化学物的潜在眼刺激性成为保障人们安全使用化妆品、日用化学品的前提。19世纪30年代，由于允许未经检测含有对苯二胺的睫毛产品在美国市场售卖，导致消费者使用此类产品引起眼部过敏、角膜溃疡和失明等不良反应。上述公共危害事件促使美国食品药品和化妆品监督管理局（FDA）在1938年采取行动，强制要求检测眼部接触产品的安全性。

对于眼刺激物的毒理学评价，传统方法采用1944年Draize提出的兔眼刺激体内实验。一直以来，虽然兔眼实验被认为是评估眼刺激或腐蚀性的唯一标准方法，但其科学性和合理性备受质疑。动物实验的缺点包括：方法的主观性、动物与人体反应的差异、动物遭受极大痛苦等。随着国际动物福利运动的兴起和新技术的发展，50多年前国外最先提出了以减少（reduce）、替代（repLace）和优化（refine）为核心内容的“3R原则”，并在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。特别是近20年，不再以动物模式为基础的测试系统已被科学家采用，并被许多国家的政府、欧洲和国际法规所接受。如欧盟化妆品指令《2003/15/EC》和法规《1223/2009/EC》对于化妆品动物实验的禁止，欧盟新化学品法规REACH（化学品的注册、评估、许可和限制）鼓励动物试验替代方法的开发和应用。美国替代方法研究评价中心（ICCVAM）提出的一系列非动物测试方法等。采用非活体动物的试验系统进行眼刺激性评价是动物试验替代技术的关键领域之一。

因此，如何建立符合动物福利原则，科学、合理的体外试验或体外实验组合，识别和区分化学品、化妆品、眼部用药品、农药和其它眼部危害物质的刺激性及其程度，是保护消费者权益的重要技术支撑。根据体内眼损伤发生的机理，目前开发中的眼刺激替代方法可分为细胞系统、鸡胚、人工角膜和离体器官四类，与其它三类相比，细胞系统标准化程度最高、成本最低而且快速。细胞系统代替体内动物实验的原理是基于大多数具有眼刺激作用的物质也具有细胞毒性，因此可根据化学物质对细胞膜损伤和对细胞质内蛋白质大分子破坏的相关性建立体外方法。用于体外测试的细胞包括成纤维细胞（如小鼠3T3细胞）、血细胞和犬肾细胞（如MDCK细胞）等，与细胞系统和其它哺动物（大鼠、小鼠、兔）相比，来源于小型猪的红细胞含量及血红蛋白水平更接近于人类。目前基于标准化实验动物小型猪红细胞系统建立的体外方法还未见相关专利和文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用小型猪红细胞系统评价眼刺激性的方法，该方法通用、快速、简便、成本低、对检测仪器无特殊要求。

本发明所提供的上述利用小型猪红细胞系统评价眼刺激性的方法，是利用化学物引起红细胞溶血和血红蛋白变性的可能性及其程度，通过预测模型，评估化学物眼刺激性的方法，该方法简与体内实验相关性好，敏感程度高，能满足常规毒性检测和机制研究的需要。

其中，用于定量指示红细胞损伤的指标包括两类，其一是红细胞溶血（血红蛋白从细胞内释放出细胞外），用于评估化学物（如表面活性剂和清洁剂）对细胞膜的损伤作用，可用分光光度计定量测定；其二是血红蛋白变性，即氧合血红蛋白变性，用于评估化学物（如酸、碱或有机溶剂，过氧化物）对细胞内大分子物质的烷化和变性作用，也可通过吸光度定量测定其变性程度。本发明基于两项指标建立的预测模型不仅可以用于待测物有无刺激性的判断，还可用于刺激程度大小的区分。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种利用小型猪红细胞系统评价眼刺激性的方法，其包含以下步骤：

一、小型猪血红细胞悬浮液的制备

取小型猪静脉血，置于抗凝管中，再加入PBS缓冲液，离心后除去上层悬浮液和白血细胞“棕黄色”层，再次加入PBS缓冲液重悬，离心，并重复上述步骤2-3次，至小型猪血红细胞与PBS缓冲液有可见明显的液面分界，将离心后的小型猪血红细胞沉淀用PBS缓冲液稀释至小型猪血红细胞悬浮液的体积百分含量为2%，将制备好的小型猪血红细胞悬浮液在4℃冻存；

二、小型猪血红细胞溶血试验

2.1范围确定试验