[发明专利]一种利用小型猪红细胞系统评价眼刺激性的方法

权利要求书

1.一种利用小型猪红细胞系统评价眼刺激性的方法，其特征是包含以下步骤：

一、小型猪血红细胞悬浮液的制备

取小型猪静脉血，置于抗凝管中，再加入PBS缓冲液，离心后除去上层悬浮液和白血细胞“棕黄色”层，再次加入PBS缓冲液重悬，离心，并重复上述步骤2-3次，至小型猪血红细胞与PBS缓冲液有可见明显的液面分界，将离心后的小型猪血红细胞沉淀用PBS缓冲液稀释至小型猪血红细胞悬浮液的体积百分含量为2%，将制备好的小型猪血红细胞悬浮液在4℃冻存；

二、小型猪血红细胞溶血试验

2.1范围确定试验

将受试物用PBS缓冲液制备如下浓度梯度的溶液：1.0 mg/L、10.0mg/L、100.0 mg/L、1000.0 mg/L、10000.0 mg/L和100000.0 mg/L，取步骤(一)中制备获得的小型猪血红细胞悬浮液，按体积比为1:2，加入上述各浓度梯度的溶液，室温下震荡培养20-40min，离心，用分光光度计测540nm时的溶血情况，测定结果与蒸馏水或去离子水处理的血液样品相比较；

2.2 主溶血试验

从范围确定实验的结果得到溶血效应发生的大概浓度范围，根据上述范围进行合理的间隔，按照几何对数或最少设置六个浓度梯度，从而得到精确的评估50%溶血即H₅₀的受试物浓度，并依次确定如下指标：

2.2.1  50%溶血受试物浓度的确定 

2.2.2 小型猪血红细胞100%溶血的确定  

2.2.3 小型猪血红细胞脆性试验 

2.2.4 受试物空白对照的确定 

2.2.5 阳性对照的确定；

2.3 溶血实验结果分析

根据2.2中获得的浓度-溶血曲线，经统计求出使50%细胞发生损伤的受试物浓度，即H₅₀值[mg/L]；

三、蛋白变性实验

如观察到红细胞溶液的颜色从红色向褐色改变表明蛋白变性的发生，蛋白变性的评估从如下两个分析模型中选择：

3.1蛋白变性定量模型一

 实验得到蛋白变性的2个定量指标分别为： 

D_low[mg/L]：使血红蛋白变性的最低受试物浓度，即吸光度相当于蒸馏水或去离子水完全溶解红细胞时吸光度的10%；

D_max[%]：与蒸馏水或去离子水完全溶解红细胞血红蛋白完全变性相比，在某一浓度下使血红蛋白发生变性的程度百分比；

根据D_low [mg/L]和D_max[%]的值，蛋白变性实验得到以下三种结果：

3.1.1在最高测试浓度或低于此浓度（100，000mg/L）检测到100%溶血或实际溶血＞95%，且一直维持到反应达到停滞期，在这种情况下，没有预期蛋白变性作用发生，无需进一步评估，结果可记为：D_max＜10%，且D_low＞10000mg/ L；

3.1.2在某一浓度检测到100%或＞95%溶血发生，但在更高一级的浓度则反应减弱，并伴随着颜色的改变，这种情况表明有溶血发生，并可能存在预期的蛋白变性，这种情况下，应从范围测试实验得到的系列浓度得出准确的D_low和D_max值；

3.1.3任何范围探测实验中的浓度均未观察到100%或＞95%溶血，在这种情况下，即使红细胞未出现溶解，细胞内任何蛋白变性的程度都应测定，测试步骤如下：

将装有体积百分含量为2%的小型猪血红细胞悬浮液离心后，小心移出其中的上清液，离心回收红细胞，按体积比为1:2，加入去离子水或蒸馏水裂解细胞，混匀后重悬细胞震荡，离心；

如总的血红蛋白释放，即移除的上清液离心后裂解释放的血红蛋白的吸光度值和检测的受试物作用后释放的血红蛋白的吸光度值之和等于蒸馏水或去离子水引起的100%溶血，表明溶血作用在任何浓度都是稳定的，无蛋白质变性发生；

3.2蛋白变性的定量模型二

实验得到蛋白变性的3个定量指标分别为： 

R₀：指空白血样在波长为575nm下的吸光度α₀与在540nm下的吸光度β₀的比值；

R₁：指受试物在波长为575nm下的吸光度α₁与在540nm下的吸光度β₁的比值；

R_SDS：指标准阳性化学物SDS在波长为575nm下的吸光度α_SDS与在540nm下的吸光度β_SDS的比值R_SDS；

从上述3个参数代入公式得出蛋白变性指数DI[%]：

DI%=×100%

四、预测模型

综合红细胞溶血和蛋白变性的定量实验结果，应用预测模型可对受试物的刺激性做出判断，视蛋白变性定量参数的不同可建立两种预测模型，预测模型的选择对最终结果的判别无影响；

4.1预测模型一

实验获得红细胞损伤的三个参数：

4.1.1  H₅₀值[mg/L]：使50%细胞发生损伤的受试物浓度，统计作图可得此参数；

4.1.2  D_low[mg/L]：使血红蛋白变性的最低受试物浓度，即吸光度相当于蒸馏水或去离子水完全溶解红细胞时吸光度的10%； 

4.1.3  D_max[%]：与蒸馏水或去离子水完全溶解红细胞血红蛋白完全变性相比，在某一浓度下使血红蛋白发生变性的程度百分比；

通常，较低的红细胞溶血H₅₀值与较高的动物实验最大平均分值（MMAS）相关，反之亦然，D_max直接与MMAS相关；

4.2预测模型二

实验获得红细胞损伤的2个参数：

4.2.1  H₅₀值[mg/L]：使50%细胞发生损伤的受试物浓度，统计作图可得此参数；

4.2.2  DI[%]：DI%=×100%；

根据H₅₀值和DI[%]的比值得出刺激指数SI，SI=；

五、分类和判断

根据上述预测模型对受试物眼刺激性及程度作出判断：

根据预测模型一实验得到的上述3个参数，依据以下分类标准，直接判断受试物的眼刺激性及其程度，

D_max≥50%，且D_low≤10000mg/L：严重眼刺激性，相当于动物实验MMAS＞80；

H₅₀≤500mg/L：严重眼刺激性，相当于动物实验MMAS＞80；

D_max≥50%，且D_low=100000mg/ L：中度眼刺激性；

D_max=20-50%，且D_low≤10000mg/L：中度眼刺激性；

H₅₀＞500，且＜10000mg/ L：中度眼刺激性；

100000mg/L浓度时无可见效应：无眼刺激性，相当于动物实验MMAS＜20；

H₅₀＞10000mg/ L：无眼刺激性，相当于动物实验MMAS＜20；

D_max＜20%：无眼刺激性，相当于动物实验MMAS＜20；

或根据预测模型二得到的刺激指数SI的大小，依据以下分类标准，对受试物的刺激性及强弱进行分类；

小型猪红细胞溶血刺激指数与眼刺激性分类判断标准

SI                   分级

≥50                无/轻微刺激性

5.0≤L/D＜50        中度刺激性

＜5.0                重度刺激性。