[发明专利]一种分泌结晶型纤维素的蓝藻工程菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌结晶型纤维素的蓝藻工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

细菌纤维素近几十年来一直是国内外生物材料领域研究的热点。英国科学家Brown早在1886年就发现：静置培养的木醋杆菌培养基表面有一层片状的纤维素物质漂浮。随着研究的逐渐深入，人们发现这种纤维素物质具备高度有序的晶体排列结构(X射线衍射结果证实这种纤维素的结晶型为I型)，高物理强度，高吸水性等特质。所以人们逐渐将此种细菌纤维素工厂化生产，进而用于生产乙醇，用于制造人造皮肤，高质量的膜类物质(如音响振动膜)，以及食品添加剂等等。但是木醋杆菌的培养成本极其昂贵，而且其生长过程中产生的各种次级代谢物，使培养废弃物的排放对环境产生严重污染，因此大规模的生产培养始终受限。菌种的改良工作一直在世界各国进行。

蓝藻作为一种能够光合自养的微生物，其低廉的培养成本，高效的生长速率以及特殊的细胞结构，为其作为产生纤维素的工程菌提供了很大潜力。木醋杆菌分泌结晶型纤维素的能力与蓝藻光合作用的特性可以进行有机的结合。

发明内容

本发明旨在提供一种分泌结晶型纤维素、培养成本低的蓝藻工程菌。

本发明提供的技术方案如下：

一种蓝藻工程菌，其特征在于，所述蓝藻工程菌为cesA基因(SEQ ID NO：1)缺失的蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002突变体；该突变体的基因组上整合并表达木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的包括7个连续的纤维素合成相关基因cmcase(SEQ ID NO：4)、ccp(SEQ ID NO：5)、acsA(SEQ ID NO：6)、acsB(SEQ ID NO：7)、acsC(SEQ ID NO：8)、acsD(SEQ ID NO：9)、bglxA(SEQ ID NO：10)在内的基因组片段CG27；

所述基因组片段CG27的长度为100392bp，起始序列为SEQ ID NO：12，终止序列为SEQID NO：13。

上述蓝藻工程菌的制备方法，包括如下步骤：

1)将蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002自身的纤维素合成基因cesA(SEQ ID NO：1)敲除或破坏，得到蓝藻突变体；

2)构建BAC载体，所述载体上连入红霉素抗性基因(Em)以及1段与蓝藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的基因组同源的1.2kb大小的DNA区域，是图4中的Homologous Region(SEQ ID NO：11)；

3)将木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582基因组中包括连续7个纤维素合成相关基因cmcase(SEQ ID NO：4)、ccp(SEQ ID NO：5)、acsA(SEQ ID NO：6)、acsB(SEQ ID NO：7)、acsC(SEQ ID NO：8)、acsD(SEQ ID NO：9)和bglxA(SEQ ID NO：10)在内的基因组片段CG27构建在步骤2)所述BAC载体上(图4)；所述基因组片段CG27的长度为100392bp，起始序列为SEQ ID NO：12，终止序列为SEQ ID NO：13；

4)将上一步得到的BAC载体转化至步骤1)产生的蓝藻突变体中，即得到了所需的蓝藻工程菌。

上述步骤1)中，用同源双交换的方法敲除所述蓝藻的cesA基因。

一种生产结晶型纤维素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)用上面所述的方法制备出蓝藻工程菌；

b)将所得的蓝藻工程菌培养在A+培养基中约1周时间，使蓝藻工程菌生长到OD值达到1.0～2.0；

c)将所述蓝藻工程菌离心富集，转移到适合于蓝藻生长的淡水培养基BG11中约2周；

d)从所述蓝藻工程菌提取纤维素。

e)经过X射线衍射检测，此纤维素与木醋杆菌纤维素都为结晶良好的I型。

在所述A+培养基和BG11培养基的培养过程中始终进行吹气培养，气体成分为空气占98％～99％，CO₂占1％～2％；培养过程始终保证温度25℃～35℃，光照强度30μE/m²s～300μE/m²s。