[发明专利]水体环境中铜绿微囊藻噬藻体的SYBR-Green荧光定量RT-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用SYBR-Green荧光定量RT-PCR技术对水体环境中铜绿微囊藻噬藻体进行定量检测和分析的方法，属于分子生物学领域。 

背景技术

蓝藻是一类原核光合自养生物，具有细菌的一些特征，因此又称为蓝细菌(Cyanobacteria)。感染蓝藻的病毒称为噬藻体（Cyanophage)，这是由于噬藻体与噬菌体非常相似的缘故。蓝藻是水华暴发的主要原因。近年来，随着经济的发展，人类活动的增加以及水体富营养化程度的提高，蓝藻“水华”的发生日益严重。噬藻体在海洋与淡水中都大量存在，并且蓝藻水华消退前后其含量有十分明显的变化，噬藻体作为蓝藻“水华”潜在的特异性生物控制因子，影响水体初级生产力的生产，其重要性逐渐为人们所认知。因此噬藻体可能是控制蓝藻水华生消的重要生态因子。 

噬藻体作为蓝藻的致死剂、基因信息载体及群落结构的调解者，广泛存在于海洋和淡水生态系统中。其海水表层水中的含量能达到细菌数量的10倍以上。海洋中感染聚球藻的噬藻体对聚球藻的日致死率最高能达到24%。因此，噬藻体对初级生产力有着不可忽视的影响。因其对细菌与蓝藻宿主的高致死率，藻类病毒在自然水体中对微藻密度具有显著的调节作用，也使得噬藻体成为水华治理过程中的“明星”。研究发现，通常情况下蓝藻水华过程中含有大量的病毒粒子，噬藻体的增殖会裂解水华蓝藻，从而导致宿主蓝藻死亡，一方面蓝藻数量变化造成噬藻体数量变化，另一方面，噬藻体对水华蓝藻的死亡有促进作用，噬藻体与藻类的数量总是保持季节性的平行关系。在发生水华的水体中，铜绿微囊藻是形成水华的优势种之一。 

自上世纪90年代，人们发现噬藻体丰富存在于海洋中，并且其在水生态系统中具有重要作用。由于各种现代实验技术的运用，现今在噬藻体的生态，分子生物学以及与蓝藻水华关系的研究上已取得一些阶段性成果。但是有待解决的问题也很多，比如噬藻体数量及其时空分布、分子进化与遗传多样性、噬藻体的生物学功能基因（特别是感染和裂解宿主的功能）等等。未来将着重利用分子生物学方法对噬藻体分布、丰度和遗传多样性、与宿主在分子水平上存在何种依存或制约关系、对初级生产力和水华的种群结构的调节作用以及实时定量检测的研究，并将噬藻体作为防治蓝藻类水华的有效生物调控因子加以利用。在加强噬藻体各方面基础研究的同时，着重研究其在水华形成与消退过程中所起的作用。 

最初，噬藻体分子生物学的研究对象主要局限于海洋噬藻体，研究深度局限于利用衣壳组装蛋白基因进行病毒检测、生态分布和遗传多样性分析。近来对淡水噬藻体的研究也得到了其应有的重视，一些现代的研究技术也被运用到噬藻体的研究当中。但研究噬藻体实时数量变化的方法还不多。 

发明内容

本发明以云南滇池为研究对象，通过SYBR-Green荧光定量PCR技术，设计特异性扩增铜绿微囊藻噬藻体尾鞘蛋白基因（g91）的定量PCR引物，现有研究主要是通过普通PCR定性研究，本发明基于SYBR-Green定量PCR定量检测噬藻体的方法，从噬藻体分子生物学层面，对待检水体中噬藻体数量及其时空分布、分子进化与遗传多样性、噬藻体的生物学功能基因（特别是感染和裂解宿主的功能）进行研究且有重要作用，从而将噬藻体作为防治蓝藻类水华的有效生物调控因子加以利用。 

水体环境中噬藻体的荧光定量PCR检测方法，包括基于铜绿微囊藻噬藻体Ma-LMM01的g91基因片段，设计得到定量PCR外参标准品引物SH-WF和SH-WR，定量PCR引物SH-RTF和SH-RTR；提取待检水样浓缩液中噬藻体DNA基因片段；利用引物对该基因片段进行荧光定量PCR扩增；对定量PCR结果进行分析。 

特异性扩增铜绿微囊藻噬藻体g91基因寡聚核苷酸的定量外参标准品引物SH-WF/ SH-WR和定量PCR引物SH-RTF/SH-RTR如下： 

SH-WF：5’-CTACCAGTGGCCGATATTTCCTT-3’

SH-WR：5’-GGTAAAGCCTCTATTAGCAGTGTTG-3’

SH-RTF：5’-ACATCAGCGTTCGTTTCGG-3’

SH-RTR：5’-GTGACAATCTGGTTAGGTAGGTCG-3’

利用定量PCR外参标准品引物SH-WF和SH-WR扩增g91基因得到荧光定量的外参标准曲线，定量PCR引物SH-RTF和SH-RTF扩增g91基因，根据结果进行统计分析待测水样中噬藻体的数量。

本发明是通过下述的技术方案得以实现的：